Nature Communications：李友军课题组揭示结直肠癌中胆固醇生物合成与抗肿瘤免疫机制

2024年7月，武汉大学等相关单位的研究人员在《Nature Communications》(IF:14.7)上发表了题为“Inhibition of DUSP18 impairs cholesterol biosynthesis and promotes anti-tumor immunity in colorectal cancer”的研究论文，揭示了DUSP18在促进免疫逃避中的代谢作用，表明免疫检查点和代谢阻断的结合是一种设计合理、基于机理的治疗结直肠癌的潜在疗法。

亮点概述：

抑制Dusp18可降低结直肠癌的生长率，而结直肠癌的生长率与高水平的CD8⁺ T细胞活化相关。
肿瘤微环境中肿瘤细胞来源的羊毛甾醇通过抑制KRAS-ERK信号传导减少CD8⁺ T细胞的活化。
Lumacaftor与anti-PD-1抗体联合使用可抑制小鼠结直肠癌生长，并协同增强抗肿瘤免疫力。

研究背景：

结直肠癌（CRC）是世界第三大流行和第二大致命的恶性肿瘤，目前的治疗方法包括手术切除和化疗。随着黑色素瘤和肺癌治疗的初步成功，免疫治疗已迅速成为许多实体癌症的主要治疗选择，而目前只有约15%的CRC患者受益于免疫检查点阻断（ICB）治疗。这种低应答率的一个原因是肿瘤细胞重塑其微环境以促进浸润的CD8⁺ T细胞衰竭和失活，从而导致“免疫逃逸”。CD8⁺ T细胞需要浸润肿瘤并特异性识别肿瘤抗原以启动特异性杀伤程序。然而，肿瘤细胞可以通过促进各种免疫抑制肿瘤微环境(TMEs)的形成来对抗这种情况。

双特异性磷酸酶（DUSPs）是一种异三聚体蛋白磷酸酶，可使酪氨酸（Tyr）、丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）残基去磷酸化，并调节与新陈代谢、致癌、表观遗传模型和生存相关的许多重要途径。DUSP18是一种很少被研究的磷酸酶，先前有报道称它能催化MAPK14去磷酸化，从而抑制TP53磷酸化，并在功能上参与肝癌细胞的恶性行为。然而，DUSP18是否调控CRC的抗肿瘤免疫尚不清楚。

研究人员通过sgRNA文库筛选，并寻找与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）评分负相关的交集基因，其中最值得注意的是Dusp18。与正常结直肠组织相比，CRC样本中DUSP18 mRNA的表达水平也较高。在DUSP18 mRNA低表达的CRC患者中，CTL评分高的患者生存率更高，而DUSP18 mRNA高表达且CTL评分高的患者生存率更低。

为了确定抑制Dusp18是否会影响T细胞介导的抗肿瘤功能，研究人员在MC38 CRC细胞和表达卵清蛋白（OVA）的B16黑色素瘤（B16-OVA）细胞中进行shRNA介导的Dusp18抑制。敲低Dusp18并不影响肿瘤细胞在体外的增殖或肿瘤在免疫缺陷裸鼠体内的生长。然而，抑制Dusp18确实会影响免疫功能正常小鼠中肿瘤生长并延长其生存时间，而清除CD8⁺ T细胞则可以消除敲低Dusp18引起的肿瘤生长劣势。因此，上述结果表明，DUSP18通过CD8⁺ T细胞依赖的方式来促进CRC的免疫逃避。

抑制Dusp18表达可增强肿瘤浸润性CD8⁺T细胞的功能

为了确定抑制DUSP18表达抗肿瘤免疫的分子机制，研究人员对shCtrl和shDusp18 MC38细胞进行RNA-seq分析。GO和KEGG分析显示，shDusp18细胞中下调的基因主要是参与胆固醇生物合成及其下游代谢途径。基因集富集分析（GSEA）也显示，与胆固醇稳态相关的基因在对照细胞中呈正富集。随后通过进一步证实，在shDusp18 MC38细胞和CKO（肠道上皮特异性DUSP18缺失的小鼠）肿瘤组织中，胆固醇生物合成基因的mRNA表达和蛋白水平下降。此外，研究人员还对shCtrl和shDUSP18人CRC HCT116细胞进行RNA-seq分析，以验证在小鼠MC38细胞中的结果。GO、KEGG和GSEA分析均显示，抑制DUSP18可显著降低胆固醇生物合成途径相关基因的表达。总之，上述研究结果都支持DUSP18通过调节细胞胆固醇的生物合成来调控肿瘤相关的免疫环境。

抑制Dusp18表达降低胆固醇的生物合成

研究人员通过实验表明DUSP18增加USF1-SREBP2转录因子轴的活性，上调胆固醇生物合成途径，接着探讨胆固醇生物合成途径中的一种或多种中间产物可能是抑制CD8⁺ T细胞功能的原因。利用胆固醇代谢组学测定shDusp18和shCtrl MC38肿瘤间质中这些中间产物代谢水平，发现在shDusp18肿瘤组织液中，胆固醇本身、多种胆固醇合成中间体、氧基甾醇和其他衍生物的水平显著降低，其中下调幅度最大的是羊毛甾醇（40%）。为了直接确定其相关性，研究人员用不同浓度的羊毛甾醇处理原代CD8⁺T细胞，结果显示羊毛甾醇以剂量依赖的方式降低了CD8⁺T细胞活化标志物CD69的表达。羊毛甾醇处理不仅能有效抑制CD8⁺ T细胞的增殖，还显著抑制细胞因子（IFN-γ和GzmB）的产生，同时促进免疫检查点分子（PD-1、TIM-3和CTLA-4）的表达，并诱导细胞凋亡。

据报道，羊毛甾醇可促进HMG-CoA还原酶（HMGCR）的泛素化和蛋白酶体降解，而HMGCR是甲羟戊酸途径中的限速酶。与此一致的是，研究人员发现在小鼠原代CD8⁺ T细胞和人Jurkat T淋巴细胞白血病细胞中，羊毛甾醇以剂量依赖的方式降低HMGCR蛋白水平。羊毛甾醇处理显著抑制小鼠原代CD8⁺T细胞中的KRAS蛋白丰度以及ERK和AKT信号传导，同时激活与细胞凋亡相关的caspase-3。与羊毛甾醇一样，唑来膦酸（一种法尼基焦磷酸（FPP）合成酶抑制剂）也能抑制CD8⁺ T细胞产生IFN-γ和GzmB。补充甲羟戊酸或FPP在很大程度上逆转了两者介导的信号抑制。这些结果表明，肿瘤来源的羊毛甾醇作为一种免疫抑制代谢物，通过降低HMGCR蛋白水平从而影响KRAS-ERK信号传导来限制CD8⁺ T细胞的细胞毒性功能。

TME中的肿瘤细胞来源的羊毛甾醇促进CD8⁺T细胞失活

鉴于DUSP18在肿瘤免疫逃避中发挥重要作用，研究人员试图鉴定DUSP18抑制剂能否作为潜在的CRC治疗方法，并通过筛选及实验验证Lumacaftor是一种有效的DUSP18抑制剂。由于Lumacaftor在体外可抑制DUSP18活性，增强CD8⁺ T细胞的抗肿瘤功能，研究人员随后在体内肿瘤模型上评估Lumacaftor的抗肿瘤作用，研究在添加或不添加anti-PD-1抗体时Lumacaftor对肿瘤生长和存活的影响。结果发现与单药组或对照组相比，联合治疗显著抑制肿瘤生长并延长MC38肿瘤免疫功能正常的C57BL/6J小鼠的生存时间。对肿瘤相关免疫细胞的分析表明，Lumacaftor和anti-PD-1联合治疗显著增加CD8⁺ T细胞的比例，但对CD4⁺ T细胞没有显著影响。联合治疗还显著提高这些CD8⁺ T细胞GzmB和IFN-γ的表达。在进行上述联合治疗的B16-OVA肿瘤免疫功能正常的C57BL/6J小鼠中也观察到了类似的结果，进一步证实用Lumacaftor抑制DUSP18可限制肿瘤免疫逃避并增强对免疫疗法的反应。