APOE4/4与阿尔茨海默病小胶质细胞损伤性脂滴有关

• 表达ACSL1的小胶质细胞在具有 APOE4/4 基因型的阿尔茨海默病患者中最为丰富。

• 纤维状 Aβ在人诱导多能干细胞衍生的小胶质细胞中以 APOE 依赖性方式诱导 ACSL1 表达、甘油三酯合成和脂滴积累。

• 含有脂滴的小胶质细胞的条件培养基会以 APOE 依赖性方式导致 Tau 磷酸化和神经毒性。

研究背景：

对阿尔茨海默病（AD）的最初描述包括在痴呆患者的大脑中鉴定出“许多显示脂肪囊状物的神经胶质细胞”。与AD相关的斑块和缠结病理相比，胶质-脂质特征在AD研究中受到的关注较少。APOE 是一种与脂质相关的AD风险基因，在AD患者的人类小胶质细胞中高度上调，而具有 APOE 风险变体的人类诱导多能干细胞（iPS）衍生的小胶质细胞（iMG）具有更多的脂滴（LDs）。有研究发现，老年小鼠小胶质细胞积累LDs，并表现出功能失调的小胶质细胞状态，称为LD积累小胶质细胞（LDAM）。

LDs在髓细胞中通过上调脂质合成酶形成，脂质合成酶是由先天免疫触发因素（如细菌）与toll受体的结合触发的。LDs本身具有抗菌特性，是巨噬细胞中先天免疫防御的一种进化保守形式。在脱髓鞘小鼠模型和人类iPS细胞模型中也观察到功能失调的小胶质细胞中富含胆固醇的溶酶体和LDs。目前尚不清楚人类 AD 脑组织中脂质积累神经胶质状态是否受到脂质 AD 风险变异（例如 APOE）的影响。AD中报道的脂质积累神经胶质细胞是否与最近发现的LDAM相似，以及脂质积累神经胶质细胞在AD发病过程中是否发挥良性、保护或破坏性作用，仍需进一步探索。

为了研究死后人类AD脑组织的转录状态与APOE基因型的关系，研究人员对诊断为具有 APOE4/4 基因型的AD患者、具有 APOE3/3 基因型的AD患者以及具有 APOE3/3 基因型的年龄和性别匹配的对照者的新鲜冷冻额叶皮层组织进行了单核RNA测序（snRNA-seq）。对照和 AD-APOE4/4 小胶质细胞之间的差异基因表达分析显示，最显著差异表达的基因是酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员1（ACSL1 ），其编码一种脂质加工酶，是LD生物发生的关键酶。与对照组相比，ACSL1在AD脑组织的小胶质细胞中特异性上调，且与AD-APOE3/3 小胶质细胞相比，在 APOE4/4 小胶质细胞中的上调程度更高。所有小胶质细胞的亚群显示，ACSL1 ⁺ 小胶质细胞构成了不同于内环境平衡和疾病相关小胶质细胞（DAM）的状态，其含有更多代谢状态调节因子（如NAMPT和DPYD）的共同表达。由于在 ACSL1 ⁺ 小胶质细胞簇中有一组 LD 相关基因，研究人员将这些 ACSL1 ⁺ 细胞称为 LDAM。AD-APOE4/4 脑组织具有最大百分比的 LDAM，其次是 AD-APOE3/3，年龄匹配的对照脑组织中最少。

随后，研究人员使用油红O（一种中性脂质染料）对AD和对照脑切片进行染色，用以测量细胞内脂质积聚。AD-APOE4/4 患者的大脑显示出丰富的核周油红色O⁺ 脂质体，其类似于LD。这些脂质体在AD脑组织中最为普遍，与AD-APOE3/3 患者相比，AD-APOE4/4 患者的脂质体略有增加，但并不显著。油红O⁺ 细胞经常出现在淀粉样蛋白 -β （Aβ）斑块的核心附近或核心处。类似的，在 Aβ 斑块附近经常观察到 ACSL1 ⁺ 小胶质细胞，表明在斑块附近含有脂质体的细胞可能是 ACSL1 ⁺ 小胶质细胞。通过精神状态检查测量，脂质体的数量与认知能力呈负相关，与Aβ斑块数量和Tau病理水平呈正相关。此外，小胶质细胞ACSL1 的表达与脂质体的相对数量呈正相关。而在小鼠相关模型中也有与人类样本类似的发现。

为了直接测试 APOE 基因型是否有助于小胶质细胞中 LD 的积累，研究人员将 APOE4/4 和同基因的APOE3/3 iPS 细胞分化为小胶质细胞，使用中性脂质荧光染料（LipidSpot）对 iMG 进行活细胞显微镜检查显示，发现与同基因 APOE3/3 iMG 相比，APOE4/4 iMG 中的 LD 积累更大。用纤维状的Aβ（fAβ）处理iMG会导致LD积累的强烈增加，而APOE4 AD风险等位基因的存在则加剧了这种情况。在APOE -KO背景下，fAβ对LD积累的影响是不存在的，相似的，LD相关基因PLIN2 和ACSL1 的表达在iMGs中fAβ刺激时上调，在APOE4/4 背景中上调幅度更大。为了确保fAβ对小胶质细胞中LDs的诱导不是这些iPS细胞系或分化方案所独有的，研究人员用fAβ处理原代大鼠小胶质细胞、原代人类巨噬细胞和小鼠BV2小胶质细胞，同样观察到LDs的积累。进一步在iMG上进行相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）成像，以确认fAβ刺激后APOE基因型之间的不同脂质积聚。fAβ处理的iMGs的CARS成像分析显示，LD光谱与不饱和（甘油三酯）光谱重叠。为了研究这些脂质是否是响应fAβ从头合成的，研究人员使用氘代葡萄糖处理BV2小胶质细胞。脂质组学分析显示，fAβ刺激后氘代葡萄糖的甘油三酯掺入呈时间依赖性增加。此外，研究人员还通过全基因组 CRISPR-KO 筛选，用以评估人类基因组中哪些特异性脂质合成基因在 LD 积累中起作用。结果表明，甘油三酯代谢调节因子是 LD 积累所需的最重要的基因类别，而 ACSL1 是 LD 形成所需的最重要的基因之一。ACSL1 抑制剂可逆转 APOE4/4 iMG 中LD在fAβ刺激下的积累。

接着，为了评估LD积累的小胶质细胞的转录组学和表观遗传学状态，研究人员对LD-高和LD-低iMG进行了流式细胞荧光分选（FACS），然后进行ATAC-seq和RNA-seq。LD-高小胶质细胞特异性的ATAC-seq峰显示与转录因子NF-κB家族相关的基序富集。与LD-低小胶质细胞相比，LD-高小胶质细胞具有更高的NF-κB相关促炎细胞因子（如TNFA 和IL1B）表达和更低的小胶质稳态标记物表达。对含有LD的APOE4/4 iMGs的表型测量表明，它们在吞噬作用、积累溶酶体和分泌炎症相关趋化因子方面表现出功能失调。

最后，为了研究LDAM对神经元的影响，研究人员将APOE4/4 iMG用FACS分为LD-高（顶部10%BODIPY信号）和LD-低部分（底部10%BODIPY信号），并在神经基底培养基中培养12h，以生成条件培养基。然后将 APOE4/4 iPS 细胞衍生的人神经元在含有10% LD-高或LD -低的 APOE4/4 iMG 条件培养基以及未处理的对照条件的完全培养基中生长。使用单克隆抗体AT8对人iPS细胞衍生的神经元进行染色，以检测磷酸化Tau（pTau）。发现只有LD-高iMG条件培养基可诱导iPS细胞衍生的神经元产生高浓度的pTau。当使用来自 APOE3/3和 APOE4/4 iPS 细胞衍生的 iMG 的条件培养基来处理人神经元时，这种效应相似，但是当使用来自 APOE-KO iMG 的条件培养基时，这种作用不存在。同样，含有较高浓度LDs的APOE3/3和ApoE 4/4 iMG的条件培养基诱导了人类神经元中半胱氨酸蛋白酶（caspase）的激活，而APOE-KO iMG的条件培养基则没有影响。

总之，该研究发现APOE4 基因型促进小胶质细胞转变为进化保守的、适应不良的和破坏性的 LDAM 状态，以响应包括 Aβ 在内的先天免疫触发因素。这为LDAM介导的AD发病机制的新假说开辟了可能性。