Science：富马酸是哺乳动物电子传递链中的末端电子受体

2021年12月，怀特黑德生物医学研究所、麻省理工学院等单位的相关研究人员在《Science》（IF: 47.7）上发表了题为“Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain”的研究论文，描绘了哺乳动物电子传递链中的一个电子流路，该电路在氧气限制下维持线粒体功能。

通过线粒体电子传递链 (ETC) 的电子流支持多种细胞过程，例如中心代谢物的合成以及信号传导和细胞死亡途径的调节。电子通过二氢乳清酸脱氢酶 (DHODH) 和复合物I等酶的活性进入ETC，通过电子载体泛醇 (UQH₂) 在复合物之间移动，并通过还原末端电子受体 (TEA) 退出。经典观点是，在哺乳动物细胞中，氧气 (O₂) 是唯一的TEA，它的还原对于UQH₂再氧化为泛醌 (UQ) 以及电子连续输入ETC是必需的。然而，在各种生理状态下，哺乳动物细胞可以存在于缺氧环境中，同时维持需要电子流入ETC的功能，包括从头嘧啶生物合成和还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 的氧化。是否有其他物质可作为TEA维持电子输入到ETC的线粒体功能尚不清楚。

为了了解O₂还原的限制如何影响依赖于电子输入ETC的线粒体功能，研究人员监测了DHODH的活性。DHODH将二氢乳清酸氧化为乳清酸，并将这些电子沉积到ETC中。由于该反应是从头嘧啶生物合成的一个步骤，可通过追踪¹³C₄天冬氨酸掺入¹³C₃-尿苷5′-三磷酸（UTP）来监测DHODH活性。用抗霉素处理人类143B骨肉瘤细胞后，¹³C₃-UTP水平保持不变，抗霉素抑制复合物III并阻止电子转移到O₂。然而，在载体和抗霉素处理的细胞中，DHODH抑制剂brequinar阻断了¹³C₃-UTP的产生。类似地，在缺氧条件下，细胞以DHODH依赖的方式维持嘧啶生物合成。因此，即使在减少电子向O₂转移的条件下，DHODH仍然可以将电子沉积到ETC中。

研究人员接着生成了143B细胞缺乏复合体 IV (COX4) 或复合体 III (UQCRC2) 的关键成分，这使得它们无法还原ETC中的O₂，结果发现DHODH 保持活性与细胞还原O₂的能力无关。药理学和遗传学实验都表明，当O₂不能用作TEA时，DHODH 会维持电子输入到ETC中，并且在这种情况下，必须存在一种（或多种机制）来维持电子流入ETC。此外，研究人员检查复合物I 的活性得到了类似的结果，当O₂不能被还原时，复合物 I 仍然可以将电子沉积到ETC中。

缺乏O₂还原的细胞保留了将电子输入ETC的能力

鉴于当 O₂ 还原不可能时，DHODH 和复合物 I 将电子沉积到ETC中，研究人员试图确定这些电子的命运。在143B细胞中，研究人员观察到在缺氧暴露、抗霉素处理和UQCRC2或COX4消耗后琥珀酸增加。通过¹³C₄天冬氨酸和¹³C₅¹⁵N₂谷氨酰胺示踪进一步探究发现，当电子不能转移到O₂时，SDH复合物催化的富马酸还原比琥珀酸氧化更多，其活性发生了逆转。此外，与活细胞中的稳定同位素示踪实验一致，载体处理的线粒体的琥珀酸氧化率高于富马酸的还原率，而抗霉素处理的线粒体的情况相反。

143B细胞的极性代谢物分析

抑制O₂还原后，富马酸通过SDH复合物的逆转来接受电子

由于UQ和富马酸的还原电位彼此非常接近（相距约10 mV），研究人员认为，UQH₂的积累可能通过抑制氧还原作用，驱动哺乳动物细胞中SDH复合物的逆转。为了验证这一点，研究人员利用了替代氧化酶 (AOX)，它以抗霉素不敏感的方式将UQH₂氧化为UQ，发现当通过维持氧化的UQ存储阻止O₂还原时，AOX表达会阻止SDH的逆转，所以UQH₂的积累是驱动SDH逆转所必需的。

在复合物III或IV活性缺乏的细胞中，替代氧化酶(AOX)对QH₂积累的潜在影响以及富马酸还原的后果

为了了解富马酸还原的潜在重要性，研究人员探究了无法使用O₂作为TEA的细胞是否需要其来维持线粒体功能，例如通过DHODH从头生物合成嘧啶，这需要电子沉积到ETC中。结果发现，同时失去电子转移到富马酸和O₂会丧失依赖于ETC电子输入的线粒体功能，并且这些功能可以通过UQH2再氧化为UQ来恢复。

AOX 表达将挽救用抗霉素处理的SDH KO细胞中复合物 I 和DHODH的活性

为了研究体内富马酸的还原，研究人员将 ¹³C₅¹⁵N₂-谷氨酰胺示踪技术应用于小鼠组织。结果发现，肺、心脏、胰腺、胸腺、白色脂肪组织 (WAT) 和腓肠肌几乎没有或没有催化可检测到的富马酸还原和高水平的琥珀酸氧化，而肾脏、肝脏和大脑似乎催化了高水平的富马酸还原，表明组织在生理O₂浓度下可能具有不同的利用富马酸作为TEA的能力。离体 ¹³C₅¹⁵N₂-谷氨酰胺追踪确定了观察到的体内标记是组织自主发生的。此外，在运动挑战时，一部分组织中富马酸的还原会增加，维持 DHODH 活性的能力与组织在抑制O₂还原后逆转SDH复合物的能力相关。

体内 ¹³C₅¹⁵N₂-谷氨酰胺稳定同位素示踪实验的工作流程，用于测量组织中SDH复合物的方向性

综上所述，该研究阐明了不需要O₂作为 TEA 的哺乳动物线粒体ETC中的电子流路。在适应O₂限制时，哺乳动物线粒体使用富马酸作为TEA。UQH₂ 在缺氧条件下或在复合物 III 或 IV 被抑制后的积累反向驱动SDH复合物，从而使电子沉积到富马酸上。富马酸还原通过复合物 I 和DHODH维持电子输入 ETC，从而实现NADH再氧化和嘧啶从头生物合成。尽管在体内，所有受试组织在缺氧暴露时都会进行富马酸还原，但只有一部分组织能够逆转SDH反应，并且只有这些组织能够维持电子输入到ETC。

SDH的逆转在减少电子向O₂的转移的条件下支持组织中某些线粒体功能的模型