Nature Metabolism: 成纤维细胞丙酮酸羧化酶是肿瘤微环境中胶原蛋白生成所必需的

2021年11月，纪念斯隆-凯特琳癌症中心、俄亥俄州立大学的相关研究人员在《Nature metabolism》上发表了题为“Fibroblast pyruvate carboxylase is required for collagen production in the tumour microenvironment”的研究论文，揭示了丙酮酸羧化酶在肿瘤纤维化和生长中的作用及相关机制。

亮点概述：

TGFβ 诱导的胶原合成与谷氨酰胺依赖性三羧酸 (TCA) 循环回补有关
GFβ 对 丙酮酸脱羧酶（PC）的抑制会损害低谷氨酰胺中的 TCA 循环回补、翻译和胶原蛋白生成
细胞外乳酸可用于通过 PC 的活性维持 TCA 循环回补和非必需氨基酸生物合成

研究背景：

成纤维细胞是间充质细胞，在伤口愈合反应中起着不可或缺的作用。在组织稳态破坏后，静止的成纤维细胞被募集到损伤部位，在那里它们被促纤维化刺激激活，以上调细胞外基质 (ECM) 蛋白（如胶原蛋白）的合成和分泌，以促进受损实质的再生。癌症的组织修复反应涉及到转化生长因子β（TGFβ）等生长因子对成纤维细胞的激活，从而形成以ECM过度沉积为特征的促结缔组织增生性肿瘤基质，包括胶原蛋白。

在体外，促纤维化刺激促进 ECM 合成的能力得到代谢重编程的支持。例如，TGFβ 分别促进葡萄糖和谷氨酰胺（Gln）的摄取以及它们用于甘氨酸和脯氨酸的生物合成，以满足胶原蛋白过度合成对甘氨酸和脯氨酸的需求。然而，人体血浆中的葡萄糖和谷氨酰胺浓度较低，并且由于血管受损和/或肿瘤细胞营养消耗过多，它们在许多肿瘤和某些类型愈合伤口的微环境中的浓度进一步降低。目前尚不清楚肿瘤微环境中的间充质细胞如何在谷氨酰胺和葡萄糖的血管递送受损时维持其 ECM 蛋白的产生。

为了研究成纤维细胞对Gln限制的反应，研究人员在存在或不存在 TGFβ 的情况下，将NIH-3T3 细胞培养在Gln浓度范围为 2 mM (100%) 至 0.2 mM (10%) 的培养基中。与高浓度Gln相比，TGFβ刺激在低浓度培养基中不再能够增加胶原蛋白Ⅰ水平，乃至细胞停止增殖。类似的结果在癌症相关的成纤维细胞（原代胰腺星状细胞 (PSC) 和原代乳腺成纤维细胞 (MFB)）中得到了验证。

研究人员进一步探究细胞外Gln浓度降低时，TGFβ 刺激的成纤维细胞中的胶原蛋白生成受损的原因。发现在低 Gln 环境中，无法维持 Gln-tRNA 充电可能导致 GCN2 的激活和 TGFβ 处理的成纤维细胞的翻译减少，从而导致 ECM 合成减少。此外，除了谷氨酰胺之外，在低 Gln 中用 TGFβ 处理的成纤维细胞中，大多数 TCA 循环中间体的游离水平显着降低，包括谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺在内的几种 TCA 循环相关的非必需氨基酸（NEAAs）也是如此。高水平的细胞渗透性谷氨酸（dm-Glu）而不是脯氨酸（m-Pro）足以恢复低 Gln 中 TGFβ 处理的成纤维细胞的生长和胶原蛋白Ⅰ水平。TCA 循环中间体 α-酮戊二酸（dm-αKG）的细胞可渗透版本也能够挽救生长和胶原蛋白Ⅰ水平。Dm-Glu 和 dm-αKG 都挽救了 TGFβ 诱导的 TCA 循环中间体和 NEAA 的消耗，并阻止了低 Gln 培养基中 GCN2 的激活。

TGFβ 诱导的胶原合成与 Gln 依赖性 TCA循环回补有关

除了用作回补底物外，αKG 还可以转氨为谷氨酸，然后可以通过Gln合成酶（由 Glul 编码）酰胺化以从头合成Gln。研究人员探究补充 dm-αKG 是否通过支持Gln从头合成来促进胶原蛋白的产生。用 dm-αKG 处理在低 Gln 的 TGFβ 刺激的细胞中恢复了Gln-tRNA 的充电，这被 GLUL 的不可逆抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺 (MSO) 阻断。用 dm-αKG 处理还抑制 GCN2 活化并促进低 Gln 中 TGFβ 刺激细胞的翻译，这取决于谷氨酰胺从头合成。用 MSO 处理可防止 dm-Glu 和 dm-αKG 在 TGFβ 处理的 NIH-3T3 细胞和低Gln中的 PSC 中恢复胶原蛋白水平。此外，在含有低Gln的培养基中，Glul缺失几乎完全阻断了TGFβ处理的成纤维细胞中补充dm-αKG和dm-Glu时Ⅰ型胶原蛋白的增加。在低 Gln 中培养的未处理成纤维细胞中，Glul 缺失导致Gln-tRNA 不带电、GCN2 激活和蛋白质翻译减少。当 Glul 被删除或被 MSO 抑制时，NIH-3T3 细胞无法维持胶原蛋白Ⅰ的合成。

当细胞外谷氨酰胺有限时，谷氨酰胺从头合成可以维持翻译和胶原蛋白的产生

TCA循环另一种主要的回补底物是丙酮酸，可通过 PC 转化为草酰乙酸。当Gln衍生的回补在体外或体内肿瘤微环境中受到限制时，一些癌细胞可以通过 PC 介导的丙酮酸回补来维持生长。为了观察成纤维细胞是否也使用PC，研究人员分析了PC mRNA（小鼠中的Pcx）和蛋白质表达。在所有分析的成纤维细胞类型中，尽管其他已知的TGF-β反应基因被诱导，但TGF-β处理降低了PC转录物和蛋白质水平。通过CRISPR/Cas9介导的Smad4缺失，证实TGFβ诱导的PC蛋白下调依赖于Smad4。

随后，研究人员通过追踪[¹³C]标记的葡萄糖（[U-¹³C]Glc）在TCA循环中间产物和相关NEAA中的命运，证实TGFβ处理会抑制PC活性，影响低 Gln 培养基中细胞生长和产生胶原蛋白。

TGFβ 对 PC 的抑制会损害低谷氨酰胺中的 TCA 循环回补、翻译和胶原蛋白生成

在缺乏TGFβ的情况下，在低Gln培养基中生长的成纤维细胞能够维持胶原蛋白的产生。研究人员接着探讨在这些条件下的胶原合成是否需要PC。发现当PC被删除时，低Gln中生长的成纤维细胞无法积累I型胶原，并且这些细胞增加了GCN2磷酸化，伴随着ATF4的积累。dm-αKG和dm-Glu均增加了低Gln培养的PC缺失细胞中的I型胶原水平。事实上，在低Gln培养的PC缺失细胞中，TCA循环中间产物和相关NEAA被耗尽。葡萄糖代谢追踪证实了PC缺失会损害糖酵解碳的TCA循环回补。当Gln的回补受损时，PC 介导的 TCA 循环回补支持胶原蛋白的产生。PC 缺失的细胞利用葡萄糖衍生的碳进行 TCA 循环回补和合成包括Gln在内的 NEAA 的能力受损。表明 PC 介导的回补至少可以部分通过支持Gln从头合成来维持胶原蛋白 I 水平。

此外， PC 的丧失导致低 Gln 培养物中基因表达的变化，胶原合成的损伤也存在于转录水平。当细胞外Gln水平低时，PC回补可支持胶原蛋白转录。

当细胞外谷氨酰胺水平低时，胶原蛋白生产需要 PC 回补

肿瘤中的葡萄糖水平也经常降低，表明用于 PC 介导的 TCA 循环回补的葡萄糖衍生的丙酮酸在体内可能受到限制。事实上，当细胞外葡萄糖浓度在含低Gln的培养基中降低时，I型胶原的成纤维细胞生产逐渐减少，提出了成纤维细胞如何支持TCA循环回补在体内合成胶原的问题。

虽然Gln和葡萄糖在肿瘤中的利用率有限，但乳酸是人类肿瘤中最稳定的代谢产物。研究人员使用统一标记的乳酸（[U-¹³C]Lac）进行了代谢追踪研究，发现成纤维细胞可以使用乳酸进行TCA循环回补。向低Gln和低葡萄糖培养的成纤维细胞补充乳酸可增加I型胶原水平。在没有PC的情况下，乳酸碳不能再用于TCA循环回补，表明乳酸在低Gln和低葡萄糖培养的细胞中拯救I型胶原的能力依赖于PC。

最后，研究人员探究了成纤维细胞衍生的 ECM 中 PC 调节的胶原蛋白水平如何影响癌细胞。结果表明，成纤维细胞 PC 支持胰腺和乳腺肿瘤的生长和纤维化。