Diabetes：陈旻和郑乐民团队揭示了膜联蛋白A1通过AMPK/PPARα/CPT1b通路调节脂质代谢减轻糖尿病肾病
2021年6月，北京大学第一医院、北京大学医学部、中科院遗传发育所、中科脂典等单位的相关研究人员在《Diabetes》（IF: 7.72）上发表了题为“The attenuation of diabetic nephropathy by annexin A1 via regulation of lipid metabolism through AMPK/PPARα/CPT1b pathway”的研究论文，揭示了ANXA1可通过调节脂质代谢来改善疾病的进展，作为糖尿病肾病的治疗靶点具有很大的潜力。
膜联蛋白A1（ANXA1）缺失可加重高脂饮食（HFD）/链脲霉素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的肾损伤。
ANXA1缺乏可促进肾内脂质积聚并驱动肾脏线粒体改变。
ANXA1 通过FPR2/ALX 抑制AMPK-PPARα-CPT1b 信号通路，增加高糖加棕榈酸（HGPA） 诱导的脂质积累、细胞凋亡和促炎/促纤维化的基因表达升高 。
糖尿病肾病 (DN) 是糖尿病最严重的并发症之一，迫切需要预防或减缓 DN 进展的新方法。炎症和代谢异常在DN的发病机制中起重要作用。促炎性巨噬细胞浸润的增加和促炎性细胞因子的释放有助于胰岛素抵抗和晚期糖基化终产物（AGE）的产生。相应地，代谢重编程通过线粒体功能障碍进一步加剧炎症过程。在这一过程中进行干预可能会减轻糖尿病患者的肾损伤。
膜联蛋白A1（ANXA1）是膜联蛋白超家族的成员，参与多种细胞过程，如细胞增殖、分化和凋亡。迄今为止，对其保护机制的研究主要集中在促分解作用，包括对天然免疫、细胞因子表达和T细胞活化的影响。此外，ANXA1被认为可以调节新陈代谢。在1型和2型糖尿病动物模型中，ANXA1已被证明能保护肾脏免受功能衰退的影响。然而，ANXA1在DN中的保护机制尚未完全阐明。
为了评估ANXA1在DN中的作用，研究人员首先构建了ANXA1基因敲除（ANXA1-/-）小鼠，用高脂饮食（HFD）加链脲霉素（STZ）处理小鼠诱导DN。结果发现，糖尿病Anxa1-/-小鼠表现出显著更高的uACR（尿微量白蛋白与肌酐的比值）水平。PAS分析显示，糖尿病Anxa1-/-小鼠的肾脏也表现出更严重的组织学改变，包括肾小球大小、系膜基质扩张和肾小管间质病变。透射电子显微镜分析显示，糖尿病Anxa1-/-小鼠的肾小球基底膜厚度和足突宽度明显大于糖尿病WT小鼠。总的来说，ANXA1基因缺失加重了DN小鼠的肾损伤。
ANXA1的基因缺失加重了 HFD/STZ 诱导的 DN 小鼠的肾损伤
为了研究Anxa1缺乏如何加重糖尿病患者的肾损伤，研究人员接着对肾皮质进行了RNA序列分析。基因集富集分析（GSEA）显示，糖尿病Anxa1-/-小鼠中下调的基因在AMPK信号、PPAR信号以及脂肪酸降解方面显著富集。这些富集的途径与糖尿病和相关的代谢紊乱有关，对调节能量代谢至关重要。热图分析发现，在糖尿病Anxa1-/-小鼠中，与脂肪酸代谢相关的基因含量大部分下调。使用 RT-qPCR 分析的选定基因（包括 Cpt1b、PPARα、脂肪酸结合蛋白 4 (Fabp4) 和激素敏感性脂肪酶 (Hsl)）在Anxa1-/-小鼠中都下调。进一步通过脂质组学对肾脏脂质谱的分析显示，Anxa1缺乏显着增加了 STZ/HFD 诱导的 DN 中各种三酰甘油（TAG）种类的水平。与糖尿病WT小鼠相比，糖尿病Anxa1-/-小鼠在近端肾小管上皮细胞（PTECs）中具有更大的脂滴。此外，糖尿病Anxa1-/-小鼠的线粒体结构严重受损，其中近端肾小管线粒体紊乱和肿胀。这些体内结果表明，ANXA1缺失促进了DN小鼠的肾内脂质积累并导致线粒体损伤。
RNA-Seq分析揭示了ANXA1在HFD/STZ诱导的DN小鼠脂质代谢中的作用
ANXA1 缺失导致 HFD/STZ 诱导的 DN 小鼠的脂质积累和线粒体损伤
为了阐明ANXA1在肾脏脂质代谢中的调控机制，研究人员随后使用慢病毒系统沉默了人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中的ANXA1。油红O染色显示用高糖加棕榈酸（HGPA）处理的shANXA1组显著增加了脂质积聚。在敲除ANXA1后，细胞的核周部位出现大量线粒体碎片，以及这些小而圆的细胞器的重新分布。此外，与HGPA处理的shCtrl组相比，HGPA处理的shANXA1组的线粒体个体、网络、足迹和平均分支显著减少。
研究人员还发现，当用HGPA处理细胞时，ANXA1敲除显著降低基础呼吸、ATP产生和备用呼吸能力，表明线粒体呼吸严重受损。与HGPA处理的shCtrl组相比，shANXA1组的FAO活性显著降低，凋亡细胞更多。此外，ANXA1沉默可增强HGPA触发的促炎症和促纤维化因子的表达，包括IV型胶原α1（COL4A1）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和肿瘤坏死因子（TNF）。
ANXA1 敲低导致脂质积累并抑制 HK-2 细胞中的线粒体脂肪酸氧化 (FAO) 活性
信号通路研究表明，HGPA处理shANXA1组的PPARα和CPT1b的mRNA和蛋白水平均显著降低。然而，WRW4 (ALX/FPR2拮抗剂)的存在以及FPR2的下调均减弱hrANXA1的调控作用，表明ANXA1通过FPR2/ALX刺激PPARα/CPT1b信号通路。在糖尿病肾脏中，主要能量传感酶AMPK的活性被抑制。研究人员用AMPK激动剂A769662处理shANXA1转染的HK-2细胞。结果发现A769662恢复了PPARα和CPT1b蛋白的表达，显著改善了脂质积累增加，部分改善了细胞凋亡和促炎症/促纤维化因子表达的增加。
结合先前的数据，表明ANXA1敲低通过 FPR2/ALX 抑制了AMPK-PPARα-CPT1b 信号通路，从而抑制线粒体FAO活性，加重脂肪毒性诱导的PTECs炎症和纤维化。有缺陷的脂肪酸氧化，以及随后的炎症、纤维化和细胞凋亡有助于DN的进展。ANXA1介导的PTECs中脂肪酸氧化、炎症、纤维化和凋亡的改善可能部分阻止这种恶性循环。
ANXA1基因敲低抑制AMPK信号传导，诱导HK-2细胞凋亡和炎症。
总之，该研究数据提供了ANXA1通过调节CPT1b和改善线粒体FAO减轻DN肾损伤的证据，提供了一个潜在的治疗机会。需要进一步研究以更好地了解 DN 中由 ANXA1 调控的分子途径。
