PNAS：魏民与冯云鹏团队揭示丁酸增强iTreg分化的机制

2021年6月，东北师范大学的相关研究人员在《PNAS》（IF: 9.58）上发表了题为“Butyrate enhances CPT1A activity to promote fatty acid oxidation and iTreg differentiation”的研究论文，揭示了一个以前未被重视的机制，即丁酸-BCoA-CPT1A调节轴，用于iTreg分化。

诱导型调节性T细胞（iTreg）在免疫抑制中起着至关重要的作用，iTreg细胞在肠道相关淋巴组织（GALTs）中富集，并且对于维持肠道免疫稳态非常重要。不同类型的T细胞具有不同的代谢特征，越来越多的证据表明，iTreg分化与代谢重编程之间尤其是脂肪酸氧化（FAO）的重新连接之间存在联系。

由一系列循环反应组成的FAO需要不同的脂肪酸（FAs），可分为长链、中链和短链脂肪酸（LCFAs、MCFAs和SCFAs）。它主要发生在线粒体中并产生乙酰辅酶 A (AcCoA)，可在三羧酸 (TCA) 循环中消耗。对于 LCFAs 的氧化，它从细胞质中的 LCFAs 活化开始，产生长链酰基辅酶A。随后，这些生成的分子通过肉碱棕榈酰转移酶 1 (CPT1) 转化为长链酰基肉碱，后者锚定在线粒体外膜上。在穿梭进入线粒体后，长链酰基肉碱会经历一系列反应来支持FAO。显然，将 LCFA s从细胞质运输到线粒体是FAO的先决条件。CPT1 是控制这一关键步骤的限速酶，因此被认为是FAO的决定因素。相比之下，SCFAs 和 MCFAs 可以扩散穿过线粒体膜并以独立于 CPT1 的方式驱动 FAO。广泛的研究表明 CPT1 在 iTreg 分化中发挥重要作用。

以前的工作表明，丁酸是一种特殊类型的短链脂肪酸 (SCFA)，可以通过微生物发酵从富含纤维的饮食中轻松产生，对于维持肠道稳态至关重要，并且作为HDAC抑制剂，其能够通过上调组蛋白乙酰化来促进 iTreg 的生成。同时，丁酸作为代谢燃料和能量来源，也可以支持结肠上皮细胞中的FAO。然而，丁酸能否调控FAO促进iTreg分化尚不清楚。

丁酸（But）促进iTreg分化过程中CPT1依赖的脂肪酸氧化

丁酸可提高酰基肉碱的含量

接着，研究人员探究FAO的调控以及丁酸对iTreg的分化是否是通过CPT1进行的。有趣的是，只有丁酸，而不是其他三种类型的FAs，显著提高了CPT1活性。重要的是，丁酸诱导的CPT1活性上调和iTreg生成被CPT1抑制剂Eto消除，表明丁酸通过CPT1促进iTreg生成。在哺乳动物中，在不同的组织中发现了三种CPT1亚型，包括CPT1A、CPT1B和CPT1C。研究人员发现CPT1A仅在CD4+T细胞中表达，并且CPT1A的敲除损害了丁酸诱导的iTreg生成。在丁酸处理后，CPT1A在mRNA和蛋白质水平保持不变，所以丁酸盐对CPT1A的调节不在转录水平。这些数据表明CPT1A在丁酸诱导的iTreg分化中起关键作用。

调节CPT1A活性有助于丁酸促进iTreg细胞分化

为了了解在iTreg分化过程中丁酸对CPT1A活性的调节，研究人员随后评估了左旋肉碱和丙二酰辅酶A（MCoA）的水平，这两种具有良好特征的代谢物以相反的方式直接调节CPT1A活性。左旋肉碱是CPT1A的底物，而MCoA是CPT1A最著名的生理抑制剂。对于丁酸治疗，未检测到MCoA和L-肉碱水平的变化。接下来，研究人员继续探讨丁酸是否可以直接调节CPT1A的活性。在体外试验中，CPT1A活性如预期的那样被MCoA下调。令人惊讶的是，无论使用分离的线粒体还是细胞裂解物，丁酸处理都不会影响CPT1A的活性。考虑到丁酸在细胞中也可以直接催化生成丁酰辅酶A（BCoA），研究人员在同样的酶活性分析中也检测BCoA。有趣的是，BCoA的加入显著增加了体外CPT1A活性，而Eto的存在阻断了BCoA介导的CPT1A活性上调。这些数据表明BCoA在控制CPT1A活性中起直接作用。

一个有吸引力的可能性是BCoA与MCoA结合在CPT1A上竞争，随后拮抗MCoA介导的CPT1A抑制。为了验证这一假设，研究人员用大肠杆菌纯化的CPT1A催化结构域建立了一个体外试验，并发现MCoA介导的CPT1A抑制实际上以剂量依赖性的方式被BCoA抑制。重要的是，用BCoA补充细胞可以挽救由于Cer（FASN抑制剂）诱导的MCoA累积而导致的iTreg生成。进一步的相互作用分析显示BCoA可以直接与CPT1A结合，其结合亲和力甚至比MCoA更高。与先前的发现一致，将CPT1A中的Arg243突变为Ala（CPT1AR243A）导致CPT1A上MCoA关联的急剧减少，证实Arg243是MCoA结合所必需的。有趣的是，在Arg243突变后，BCoA与CPT1A的关联也被显著破坏，这表明BCoA可能与CPT1A中的同一位点相互作用。综上所述，这些结果表明BCoA与MCoA竞争调节CPT1A活性。

丁酰辅酶A与CPT1A结合以对抗丙二酰辅酶A介导的抑制

BCoA似乎以剂量依赖性的方式刺激iTreg的产生。为了确定在iTreg中负责催化丁酸转化为BCoA的酶，研究人员随即关注酰基辅酶A合成酶（ACS），包括短-（ACSS）、中-（ACSM）和长链（ACSL）家族，据报道，这些家族可在哺乳动物细胞中将游离脂肪酸转化为酰基辅酶A。考虑到丁酸分子包含四个碳原子，研究人员筛选了ACSS和ACSM家族的所有成员，发现iTreg细胞只表达ACSS2，没有其他中短碳酰基合成酶。当重组ACSS2与丁酸孵育时，很容易检测到BCoA。

丁酸对iTreg细胞的诱导依赖于ACSS2生成丁酰辅酶A

由于丁酸盐与促进结肠Treg细胞和减轻结肠炎有关，推测BCoA和ACSS2可能在丁酸依赖性结肠炎调节中起重要作用。为此，研究人员利用小鼠模型研究ACSS2 BCoA在结肠炎中的作用。结果发现，丁酸治疗显著减轻了小鼠结肠炎相关的病理改变，并增强了肠系膜淋巴结（MLN）和结肠固有层（cLP）中的Treg细胞频率。重要的是，对ACSS2的抑制降低了这些小鼠中丁酸介导的效应。同样，这些体内数据表明ACSS2在丁酸介导的结肠炎小鼠iTreg分化中起着不可或缺的作用。此外，除了iTreg细胞外，其他肠道细胞也可能受到丁酸-ACSS2-BCoA轴的调节，从而有助于丁酸介导的结肠炎缓解。

ACSS2是丁酸介导的减轻小鼠结肠炎所必需的

综上所述，该研究揭示了丁酸在iTreg分化中的一个以前未被重视的作用，并确定ACSS2是催化丁酸转化为BCoA的负责酶。通过与MCoA竞争，BCoA调控CPT1A的活动，以支持FAO产生iTreg。除了HDAC抑制剂外，丁酸还可以作为一种代谢调节剂，驱动FAO中iTreg分化所需的改变。一方面，丁酸以CPT1A依赖的方式调控FAO；另一方面，它支持FAO作为碳源作出直接但有限的贡献。