JGG: 脂质组学和代谢组学整合深入了解细胞机制和疾病进展

脂质组学已被广泛用于研究各种机体模型和人类疾病的脂质代谢，这已在其他地方进行了综述，因此将不会是本节的重点。本文将讨论个别脂质分子或脂类在某些疾病(包括代谢综合征、痴呆、心血管疾病和各种癌症)中的作用，以阐明脂质组学有助于精准定量和精确鉴定脂质的重要性。

脂肪酸是各种生物活性脂分子和膜脂的能量来源和前体。高水平的血浆游离脂肪酸（FAAs）可能是白色脂肪细胞膨胀、低能量消耗和/或β-氧化紊乱的标志。在肿瘤方面，三酰甘油酯水解释放的游离脂肪酸被转移的卵巢癌细胞吸收并用作能量来源。

作为各种生物活性脂类的前体，不同的游离脂肪酸种类参与了多种疾病的发生和发展。例如，游离花生四烯酸在MYC活性高的肺肿瘤中增加。MYC过表达通过脂氧合酶(LOX)和环氧合酶(COX)途径提高花生四烯酸类二十烷酸的水平。抑制COX/5-LOX途径可减少细胞增殖，从而减轻肿瘤负担，并强调花生四烯酸及其衍生二十烷酸在癌细胞增殖中的作用。棕榈酸已被证明可触发内质网应激，促进肾近端小管细胞系的凋亡和坏死细胞死亡。膜磷脂中多不饱和脂肪酸的裂解释放出多不饱和脂肪酸，导致二十碳烯酸生物合成显著上调，从而降低了秀丽隐杆线虫幼虫的寿命。

脂肪酰基组成的改变会严重改变膜的流动性、厚度、包装以及膜蛋白的动力学和功能。例如，增加饱和磷脂(PLs)水平会导致癌细胞的信号转导发生改变，从而保护癌细胞免受氧化损伤，并抑制其对化疗药物的吸收。从阿尔茨海默病(AD)患者的大脑中分离出的脂筏显示出n-3多不饱和脂肪酸(特别是二十二碳六烯酸，DHA)、单烯类(主要是油酸)水平降低，过氧化物指数降低。此外，AD额叶皮质和内嗅皮质中的脂肪酰组成差异被证明能产生更高程度的膜序和粘度，这一点通过它们对人工探针的更大抗性得到证实。通过观察β-分泌酶在AD受试者的这些改变的膜微区中的特异性聚集，进一步加强了这些膜脂肪酰基改变与AD发病的生物学相关性，因此，在膜微区的脂肪酰组成变化和淀粉样前体蛋白（APP）的淀粉样形成过程之间提供了直接的联系。同样，在恒河猴神经膜的正常衰老过程中，观察到含有DHAs的磷脂减少伴随着极长链鞘磷脂（VLC-SMs）的增加，提示随着正常衰老过程，这些膜可能引起富含DHA的微结构域与筏（SM/胆固醇）微结构域的时间依赖性交换。这些发现进一步强调了脂质组学在研究膜脂肪酰成分对神经退行性疾病细胞过程和信号转导的影响中的应用。

鞘脂主要包括神经酰胺、鞘磷脂（SM）和鞘糖脂，并根据细胞环境表现出广泛的生物学功能。血浆和组织中鞘脂水平的改变显示糖尿病患者心血管并发症的风险增加。此外，脑鞘脂分布在衰老过程中也有酰基链长度特异性改变。一般来说，神经酰胺水平在稳定的冠心病、AD、高血压、肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗（IR）中升高。富含神经酰胺的低密度脂蛋白（LDLs）可导致IR，并促进IL-6介导的巨噬细胞炎症反应。神经酰胺增加线粒体膜通透性，促进凋亡因子的释放，从而触发caspase级联反应，构成细胞凋亡的内在途径。有趣的是，发现不同的神经酰胺种类（脂肪酰碳原子数从14到26）导致不同的生物功能。据报道，C16:0神经酰胺具有促凋亡和加重肥胖相关IR的作用，而C24:0等长链神经酰胺具有促进细胞增殖的抗凋亡作用，其作用与短链神经酰胺有很大的拮抗作用。在大鼠早期肝脏IR的研究中观察到了相似的结果。

SMs与促进大脑中的细胞增殖有关。髓鞘层中高水平的SMs以前被发现存在于HD患者的心室下区(SVZ)，这被认为是为了增强对邻近退化尾状核刺激的接收，从而促进细胞增殖和神经发生，以补偿神经元细胞的死亡。神经节苷脂是一类由一种或多种唾液酸与糖链相连的脂质。GM3是这个复杂的脂质家族中最简单的成员，被认为是大脑中内生性丰富的神经节苷脂a-和b-系列生物合成的重要前体。血浆GM3水平升高也与IR、2型糖尿病（T2DM）和帕金森病（PD）有关。在PD中观察到通过内吞途径内化的GM3的溶酶体降解减少。GM3还被发现可以使用人工脂质体在体外加速α-突触核蛋白的聚集，而剩余的磷脂则减缓了聚集。此外，脂质组学分析先前报道SM和GM3的疾病依赖性改变都是脂肪酰特异性的。

胆固醇是动物细胞中含量最丰富的脂类之一，它不仅是细胞膜的基本组成部分，而且是类固醇激素、胆汁酸和维生素D生物合成的前体。胆固醇与细胞内转运、细胞信号传导等多种细胞功能有关。胆固醇在动脉粥样硬化的发生和发展过程中起着关键作用，因为已知游离胆固醇和胆固醇酯水平的升高会导致不稳定的斑块。此外，胆固醇在促进牙菌斑进展和继发性牙菌斑特征的炎症方面也发挥着关键作用。胆固醇作为脂质筏的主要成分，通过富含胆固醇的膜微区调节阿尔茨海默病中APP的淀粉样变过程，并调节癌细胞的存活和死亡。

代谢组学是指对细胞过程的化学指纹图谱进行系统研究，主要是对氨基酸、碳水化合物、有机物等小极性分子(代谢组)进行定量和/或定性分析。由于代谢组是细胞过程的最终产物，其综合分析(代谢组学)提供了机体最相关的功能读数或生理状态。

氨基酸紊乱可由氨基酸的合成或降解受损引起。代谢组学研究表明，支链氨基酸（BCAA）及其相关代谢物与IR的关系比脂类更密切。BCAA可以作为预测糖尿病事件和干预/治疗结果的生物标志物。BCAA水平升高与T2DM表现相关，可能反映了IR状态。BCAA水平升高可能与BCAA分解代谢受支链-酮酸脱氢酶复合物(BCKD)调节有关。通过脂肪信号介导的BCKD复合物的数量和活性的降低可以抑制BCAA的分解代谢和清除。与BCAA水平升高形成对比的是，在预测研究和显性糖尿病中，甘氨酸水平均降低。推测甘氨酸的减少是由于氧化应激引起的糖异生增加、谷胱甘肽消耗增加和谷胱甘肽合成减少。与2型糖尿病的观察结果相似，不同的氨基酸在中风发病的不同途径中发挥作用。据报道半胱氨酸与缺血性脑损伤有关。在中风早期恶化的患者中，半胱氨酸浓度升高。其有害作用可能是由其下游产物硫化氢介导的。氧化谷胱甘肽导致氧化应激，并可能通过增加活性氧化物导致缺血性中风。谷氨酸的过量释放促进钙流入神经元，从而引起神经毒性、神经元细胞死亡和脑损伤。色氨酸代谢在中风发作时被发现改变。它通过主要途径——犬尿氨酸代谢途径氧化，参与炎症反应、氧化应激、内皮功能障碍、颈动脉斑块扩大和脑缺血。

在肥胖、糖尿病、肿瘤和缺血中，碳水化合物代谢显著改变。各种碳水化合物（包括葡萄糖、果糖、乳酸和葡萄糖酸）含量的增加表明肥胖患者碳水化合物分解代谢受到干扰。由于肥胖和糖尿病密切相关，在糖尿病中也观察到类似的碳水化合物变化。一些代谢组学研究也显示，，包括葡萄糖、甘露糖、果糖和己糖在内的糖，甚至在2型糖尿病临床症状出现前3-7年就增加了。葡萄糖摄取的增加及其在糖酵解中的利用导致乳酸生成的增加是肿瘤发生的第一个适应性事件。在缺血期间，也观察到乳酸分泌的增加，这可能意味着大脑对恢复能量平衡和防止神经元凋亡的保护作用。

三羧酸（TCA）循环是通过氧化来自所有需氧生物的碳水化合物、脂类和氨基酸生成的乙酰辅酶A的能量释放形式的三磷酸腺苷（ATP）的关键手段。现有的肥胖和T2DM发病机制认为，β-氧化增加骨骼肌代谢超负荷的速率可能会导致TCA循环支持不完全的β-氧化导致的中间产物，从而导致IR。采用无偏和有针对性的代谢组学方法，我们发现在AD患者中，参与线粒体穿梭的关键代谢物，如柠檬酸和苹果酸的水平明显改变，这可能是AD脑线粒体功能障碍的基础。

在动脉粥样硬化形成过程中发现肠管通向心脏轴是一系列典型的代谢组学和脂质组学研究相结合的典型例子，这有助于阐明在心血管疾病（CVD）中最终发生的精确通路改变。代谢组学分析首次发现，血浆中与磷脂酰胆碱代谢有关的三种代谢物，即胆碱、甜菜碱和三甲胺- N -氧化物(TMAO)的水平是临床人群中CVD的有效预后指标。使用小鼠模型的机制研究显示，饮食补充胆碱可增强多种促动脉粥样硬化巨噬细胞清除受体的活性，而这些受体在无菌小鼠中丢失。在另一项阐明人类血浆TMAO决定因素的研究中，根据TMAO和胆碱的中位浓度对人群中磷脂酰胆碱、胆碱和TMAO的水平进行了脂质组学和代谢组学的同时监测。在逐步回归模型中，发现血浆磷脂酰胆碱是TMAO的负决定因素，而三甲胺和胆碱是正决定因素。这些发现累积验证了磷脂酰胆碱、胆碱、三甲胺（TMA）和TMAO在CVD进展方面的生物学联系，并加强了从磷脂酰胆碱的饮食摄取中释放的胆碱首先被宿主酶代谢形成气态TMA的机制性建议，随后又形成气态TMA被肠道微生物捕获并转化为TMAO。向血流中释放TMAO可促进巨噬细胞对胆固醇的吸收，并减少胆汁酸的产生，胆汁酸是胆固醇排泄的关键途径（图4）。这些细胞过程导致胆固醇积聚增加，促进富含胆固醇的巨噬细胞的形成，最终导致动脉粥样硬化斑块。除了揭示疾病病理学之外，代谢组学和脂质组学的结合无疑也为缓解心血管疾病提出了几种新的治疗方案，如饮食干预或使用益生菌调节内源性TMAO生成。

已经尝试用单一提取程序或双相提取方法分析代谢组学和脂质组学，这将允许从同一样品中分析不同种类的生物分子。一些新的分析技术有助于在单一分析过程中同时分析代谢组和脂质组，其中包括单一提取法、双相提取的叠层进样法和二维液相色谱-质谱法。通过这些方法，在一次分析运行中获得了合理的覆盖率和提取效率。尽管如此，化学极性的差异加上结构鉴定需要单独的代谢物库，这意味着至少在短期内，代谢组学和脂质组学在分析策略方面仍将保持很大的独立性。在分析数据采集的下游生物基础上，整合和统一代谢组学和脂质组学数据仍然是代谢组学和脂质组学集成的首选方法。

整合代谢组学和脂质组学数据弥补了代谢网络中信息的缺失，支持同一假设的多个正交证据来源减少了错误发现的机会。因此，数据整合在揭示两个组学之间的复杂关系和提供一个全面的代谢状态方面具有巨大的潜力。总体而言，整合组学数据分析旨在回答三个问题:(1)不同组学数据集的哪些特征最能解释有趣变量;(2)组学数据集之间如何相互关联;(3)通过整合组学数据集可以得出哪些功能解释。每个问题都需要不同的方法来解决，但通常的策略是降维(图6)。降维是高维数据分析的一个重要步骤，尤其是在组学数据分析中，因为组学数据具有极高的高维性、高度相关性和噪声。毫不奇怪，由于具有大量的特征和相当大的复杂性，降维在任何综合组学数据分析中都是至关重要的。用于组学数据综合分析的降维技术可用于一个组学数据集(单独或连接的脂质组学和代谢组学数据集)，如主成分分析(PCA)、多因素分析(MFA)和非负矩阵因子分解(NMF)。对于组学数据集对，可以采用典型相关分析(CCA)和k表偏最小二乘法(multi-blockPLS)等方法，而广义CCA通常用于多个组学数据集。这些统计方法中有许多是基于投影的方法，如PCA、CCA和PLS，这些方法通过一些未被观测到的潜在变量或成分来归纳样本，这些潜在变量或成分是原始变量的线性组合，使得样本可以在一个小维度空间中进行分类和可视化。在线性组合中，一个分量中原始变量的权值由一个加载向量表示，通常大部分的权值都是非零的，这表明仍然考虑所有原始变量。为了获得更高的效率和可解释性，以及控制过度拟合，通常使用正则化技术共同选择变量，例如稀疏主成分分析（sPCA）、正则典型相关（rCCA）、稀疏偏最小二乘（sPLS）等，其他地方也有一个全面的总结。另外值得注意的是，另一个R包mixOmics提供了多个omics数据集的多变量分析，重点放在数据探索、降维和可视化上。

随机森林(randomforest, RF)等机器学习方法也被应用于集成多个组学数据集(图6)。随机森林是决策树的集合，每个决策树都在一个随机变量子集上的原始数据的随机引导样本上进行训练。RF选择从森林中所有树中获得最多“投票”的分类。RF在大数据集上高效运行，具有内置的连续和分类变量的输入方法，可以有效地处理组学数据中的缺失数据，以及相关的临床和表型数据。另外，RF可以通过原始数据的分类结果与变量值置换后的分类结果的差异来估计变量的重要性，这有助于候选生物标记的选择。此外，变量选择可以通过迭代消除变量重要性最低的变量，并在测试数据上评估模型性能来实现。

对组学数据和相关的临床和表型数据进行分析，往往会得到丰富的信息，包括代谢物/脂类的差异、褶皱变化以及相关、偏相关、比值比等关联强度。为了使研究人员在系统水平上更好地理解分子机制，还必须考虑代谢物和脂类之间的生化关系及其结构上的相似性。基于网络的数据集成方法擅长这方面的极大的灵活性和可伸缩性(图6)。通常情况下,网络中节点代表代谢物和边代表关系,属性等代谢物的P值,褶皱的变化,化学类可以被映射到节点的颜色,大小,形状,和属性的关系可以被映射到边缘宽度、线路类型、颜色等。R语言igraph包提供了用户友好的方法来构建和操作一般的网络图，以及用于网络分析的算法，包括中心和模块识别。其他的R包，如WGCNA, MEGENA和MetaMapp，为更专业的网络提供了不同侧重点的方法，如网络结构分析和生化及通路信息的整合。这样的分析可能在分析复杂的代谢关系时特别有用，这些关系显示出高度的互联性，例如脂质网络，以揭示不同生理状态下代谢物相互关系的变化。例如，MEGENA发现，与发病前4年的对照组相比，发病糖尿病患者的多不饱和pPEs和TAGs之间的相关性发生了改变，揭示了可能导致糖尿病发病时明显血脂异常的候选通路。

图6. 显示组学数据集成策略的通用模式。

代谢组学和脂质组学已经成为解决各种基本生物学问题以及描述人类疾病分子病理生理学的主要工具。特异性代谢产物/脂质具有独特而显著的功能特性，在调节细胞增殖、代谢、细胞器功能、细胞内吞、自噬、应激反应、凋亡、信号转导、衰老等方面发挥着独特的作用。虽然路径分析迫切需要更全面的信息，但科学家们正在不断努力开发高覆盖率的组学方法，例如广泛分析各种鞘脂的综合平台、高覆盖率的全局脂质组学方法和高覆盖率的靶向代谢组学方法。在未来，色谱和质谱技术的进步将进一步有助于扩大代谢物和脂质的覆盖范围。尽管代谢组学和脂质组学都对促进我们对疾病进展的细胞机制的理解作出了重大贡献，但很明显，单一组学方法未能考虑到两种方法所涵盖的分析物的细胞代谢中的高水平互连性。

虽然分析上的可行性已经将脂质组学从更广泛的代谢组学领域中划出界限，但将代谢组学和脂质组学结合起来处理临床和生物学问题显然是完整的代谢全貌所必需的，这是回答细胞生物学和疾病病理学中各种基本问题的先决条件。协同组学方法有几个优点，例如提供一整套分子变化和全局特征，突出脂质和其他代谢物之间的共同细胞机制，使全面的网络分析能够识别疾病病理学中的关键代谢驱动因素，促进脂质和其他代谢产物在疾病进展中相互联系的研究。尽管在代谢组学和脂质组学的各个领域内有相当大的技术进步，但仍然存在局限性和挑战。除了由化学性质的巨大差异所施加的分析挑战之外，联合代谢组学/脂质组学方法还在数据分析、处理和解释方面增加更大的复杂性。除了不断深入研究代谢组学和脂质组学各自的领域之外，在生物学基础上进行数据解释的收敛方法可能最终解决为细胞生物学和疾病病理学提供迄今为止仍然难以捉摸的关键线索的问题。