Nature Methods：脂质代谢的多重示踪与单细胞示踪

细胞脂质代谢是一个复杂的网络过程，包括几十种酶、多种细胞器和上千种脂质。追踪这个网络中的代谢反应是一项重大的技术和科学挑战。脂肪酸含有正常营养中约三分之一的热量，但我们对其代谢动态的了解有限，特别是在单个脂质种类的水平上。使用稳定同位素标记的质谱示踪的主要问题是在细胞提取物的背景中鉴定出同位素标记的化合物。虽然通过有针对性的分析可以发现已知的、有限反应的物质的代谢物，但标记的脂肪酸被并入数百种产物中，使分析复杂化。因此，现有同位素标记脂肪酸的示踪数据仅限于少数标记种类，缺少一种在种类水平上进行全面追踪的方法。

以质谱（MS）为基础的脂质组学中的种类分辨追踪系统为代谢分析开辟了新的途径。2019年10月，波恩大学的相关研究人员在《Nature methods》上发表了题为“脂质代谢的多重示踪与单细胞示踪”的研究论文。研究人员开发了一种特定的、高度灵敏和稳健的炔烃标记脂质追踪程序。该方法支持样本多路复用，从而改进了样本比较。而低于毫微微克分子的检测灵敏度使研究人员能够对中性和膜脂中的脂肪酸进行单细胞分析。

研究人员首先设计了一个Click-MS reporter C171（图1a），在功能上取代以前的荧光报告分子。该分子有助于标记产物的离子化，以特别增强其信号，给出一个可预测的质量位移，允许在MS1水平上直接识别，并给出一个诊断碎片，以在MS2水平上搜索标记化合物。其特征在于带电报告基团、连接基团和与端基炔烃反应的叠氮基团，其名义质量位移为171Da（图1b）。C171最重要的特点是它在MS2中意外地碎裂：在中等碰撞能量下，标记化合物通过消除二甲基乙胺基团显示出73.09Da的定型中性丢失（neutral loss，NL）（图1c）。未反应的C171没有显示出这种中性丢失，表明三唑环协助消除了中性丢失，形成了双环结构(图1b)。该73.09的中性丢失是中性脂类的诊断反应，能够识别酰基甘油、神经酰胺、甾醇酯和游离脂肪酸。

磷脂还有平行的磷酸二头部基团的中性丢失，从而形成[DAG-H2O]+ (图1d)。双环三唑的正电荷有利于头部基团的中性丢失，也有利于通常会失去阳性头部基团碎片的磷脂，即磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)。通过对MS2中的[头基+二甲基乙胺]的中性丢失分析，可以有效地识别出标记的磷脂。将特征前体质量和特征碎裂的组合用于LipidXplorer自动识别标记脂质，这为计算中的前体、片段和化学逻辑提供了必要的灵活定义。

图1. click-ms-reporters的结构和功能

在生物分析中，多路复用提高了样品的产量，降低了技术噪音，节约了成本。液体处理的定量变化、喷雾的不稳定性和碎片的波动至少可以通过多路复用得到部分补偿。为此，研究人员合成了另一组试剂。与蛋白质组学中串联质量标签和等压标签用于相对和绝对定量实验的逻辑相似，研究人员分配重同位素，使得所有试剂具有几乎相同的175.18Da质量，但在77和73Da之间具有不同的NL，并通过连接器进行平衡（图1a和2a）。肝细胞用aPal标记5 min，然后追踪0、5、20、40 min，将脂质提取物与不同的C175试剂反应，反应后混合，进行质谱分析(图2b)。图2c描述了在m/z 745.69处对内部标准DAG(32:3-d8)进行的四步MS2分析:二甲乙胺基的NL碎片产生了四个不同的质量，每个质量代表四个输入样本中的一个。对来自同一个多重样本（图2c，右）的细胞衍生DAG（33:4）的平行分析显示，强度差异代表了各个单一样本中的物种数量。

图2 . 多重代谢追踪

接着，为了分析脂肪酸代谢，研究人员用aPal或aLino脉冲标记原代小鼠肝细胞5分钟，然后分别追踪0、5、20或40分钟，处理样本如图2b所示。将数据归一化至内部标准后，计算其绝对含量，得到总脂肪酸含量(图3a)。根据未标记细胞的平行脂质组学，1200 pmol标记脂质相当于1.4%的细胞总脂质。以mol%表示的脂类的和强度(图3b)显示，标记的DAG代谢迅速，产生PC和TAG，而PE和PI的总分数在追踪期缓慢增加。随着时间的推移，侧链C原子和双键的加权平均数增加（图3c，d），表明脂类的种类重塑。

图3. 图2b所示实验的脂质类水平分析

随后，在脂类种类水平上进一步分析(图4)，每个种类的相对丰度显示在四个分析时间点上。脉冲被aPal + a17:2(即双aPal)控制后，DAGs的组成(图4a)为16:0、16:1和18:1、18:2，并逐渐向长、多不饱和种类转变。PC(图4b)的组成与DAG相似，但存在一些特征偏差:FA16:0和16:1被低估，20:4和22:6被严重高估。典型的肝脏PC, FA18:2比18:1丰富。随着时间的推移，除了a17:2种类退化到16:0种类的水平外，几乎没有变化。PE(图4c)中含有90%的多不饱和FA (PUFA)，且几乎没有重构，而PI(图4d)则呈现出20:4的特征优势，这种优势随着时间的推移而增加，但以牺牲较短的脂肪酸为代价。

图4. aPal标记甘油脂质的脂肪酸重塑

在种类水平上(图5)，DAG主要包含FAs 16:0、16:1、18:0和18:1。几乎没有FA20:4或FA22:6与aLino结合。在5分钟的追踪中，双aLino DAG的初始强度峰值迅速降低(从310下降到32 pmol)，相应的PC和PE种类也观察到这一现象。对于PC, 16:0-aLino种类的比例在追踪40min后逐渐增加，直至成为优势种类，这与内源PC对FA16:0-18:2的偏好一致。PI发生了重构，强双aLino和FA18:2组合迅速降解。FA18:1开始补偿了PUFAs的减少，然后随着FA16:0和FA18:0成为主要种类(从9到47%)而减少。

图5. aLino标记甘油脂质的脂肪酸重塑

在单细胞代谢追踪研究中，为了实现单细胞的敏感性，研究人员将样品体积从500微升减少到20微升，并将数据记录调整为小样品体积的有限喷雾时间。采用极限稀释法对细胞进行采样，共鉴定出46种标记PC、TAG和双标记TAG。在每个试管0.5个细胞的名义浓度下，研究人员观察到几个标记脂质含量非常低的样品（图6a，样品2和4-10）和两个含量较高的样品（图6a，样品1和3）。在较高的名义浓度下，低计数的频率降低，强度发生较大变化，与样品中细胞数量的预期泊松分布一致。研究人员通过减去样本6-9的平均值，乘以一个解释样本稀释的因子，对数据进行背景校正。使用修正后的数据集(图6b)估计样本中的细胞数量。有一个群体的总标记脂质从120到290 fmol不等。由于肝细胞表现为单核和双核细胞，细胞体积变化较大，因此可以合理地假设该群体由单个细胞组成，而300至600 fmol之间的群体为两个细胞。

图6. 在脂类水平上进行单细胞脂肪酸示踪分析

整个方法关键取决于两个先决条件：即click reporters的性能和炔烃前体分子的可用性和可靠性。click-reporters大大提高了敏感性和特异性，并能在高敏感的MS阳性模式下进行全面的脂质分析。在MS2分析中，试剂给出了特征的NLs，因此标记的脂质主链仍然以带电片段的形式出现。这提高了分析的特异性，因为每个标记的物种都是由两个特定的离子来定义的，这使得MS2中的等压物种得以分辨，而这对于带有电荷的报告离子来说是不可能的，比如184.07 Da磷胆碱头基。此外，定量得益于1Da窗口中MS2扫描的高灵敏度，特别是对于单细胞测量。微量组分通常在MS1中没有峰，而在MS2中，前体和碎片都被检测到，从而可以进行明确的识别和定量。click-reporters的另一个重要特性是样本复用的能力。这节省了四倍的时间和其他资源，减少了随机实验噪声，提高了样本比较。为了广泛应用该方法，许多不同的烷基标记的前体分子是可用的，包括简单的脂肪酸，甾醇和鞘脂类以及复杂的脂类。本研究的多路脉冲追踪实验证明了炔烃脂肪酸示踪的可靠性。

简评：单细胞测序工作正开展得如火如荼，但单细胞脂质组学仍然在技术层面上面临一些挑战。尽管上述方法采用有限稀释法获得单个细胞进行分析，没有采用膜片钳、微毛细管单细胞捕获等技术，也不是真正意义上的脂质组学分析（既不能追踪由乙酰辅酶A从头合成的脂肪酸，也不能追踪由β或ω氧化降解的脂肪酸，更不能获得其他脂类如鞘脂等的谱纹信息），但其在对脂质代谢示踪方面的多通路整合分析还是非常值得肯定和具有潜在的重要应用前景。此外，由于需要在用于示踪的脂肪酸末端引入端基炔烃，有可能对其合成的相关脂质如磷脂等的空间等的结构与特定功能产生一定影响，这也是以后应用此方法可能需要注意的一个问题。