JGG: 脂质贮存调控因子CdsA对果蝇变态发育至关重要

2019年4月，中国科学院遗传与发育生物学研究所、中国科学院大学相关研究人员在《Journal of Genetics and Genomics 》上发表了题为“脂质贮存调控因子CdsA对果蝇变态发育至关重要”的研究论文。

类固醇激素是调节动物发育、生长、代谢、炎症、免疫反应和生殖等多种生理过程的主要生物活性脂质之一。在昆虫中，类固醇激素-蜕皮酮和20-羟基蜕皮酮（20E）触发主要的过渡事件：蜕皮和变态发育（Thummel，1996年）。在果蝇中，蜕皮酮的合成主要发生在前胸腺中，前胸腺是一种内分泌腺，表达一系列羟基化和氧化步骤所需的大量蜕皮酮生物合成酶。蜕皮酮从前胸腺释放后，在外周组织中转化为其活性形式20E，并与受体EcR/USP复合物相互作用，启动蜕皮激素反应基因的转录，最终导致发育转变（Thummel，1996；Petryk等人，2003；Yamanaka等人，2013）。

果蝇的遗传研究成功地鉴定了许多蜕皮酮生物合成酶和信号途径，包括调节蜕皮酮产生和释放的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、钙和cAMP信号转导途径（Gilbert等人，2002年；Huang等人，2008年；Yamanaka等人，2013年）。

脂质和脂质相关因子也参与蜕皮甾体生成。dnpc1a和dnpc2突变体在细胞内胆固醇转运方面存在缺陷，在幼虫阶段就被发育抑制，可通过外部提供蜕皮酮而拯救发育到成虫（Huang等人，2005；Huang等人，2007）。果蝇肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）受体ITPR（IP3激活的细胞内钙通道之一）的破坏导致延迟蜕皮和致死，通过向突变幼虫喂食蜕皮酮可以部分挽救这一现象，这表明，在蜕皮酮介导的发育转变中需要IP3信号。（Venkatesh 和 Hasan，1997）。尽管有这些发现，脂质代谢和蜕皮激素信号之间的因果关系尚不完全清楚。

为了确定更多参与脂质储存调控的基因，研究人员用ppl-Gal4对果蝇幼虫唾液腺进行了一步RNAi筛选。筛选出大约1200条与编码假定内质网定位蛋白、激酶或转录因子的基因相对应的RNAi序列。研究人员发现55个基因的RNAi导致唾液腺脂滴异位表型（表S1）。在CdsA RNAi和bbc RNAi中观察到最强的脂质异位储存表型（图1A和S1A）。CdsA是唯一一种果蝇CDP-二甘油酯合成酶（Cds），它通过胞苷二磷酸二酰甘油（CDP-DAG）将磷酸（PA）从TAG合成转移到磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰甘油（PG）合成。bbc编码果蝇胆碱/乙醇胺磷酸转移酶（C/EPT）同系物，它催化CDP胆碱或CDP乙醇胺和DAG反应生成磷脂酰胆碱（PC）或磷脂酰乙醇胺（PE）。具有CdsA无效等位基因的果蝇在胚胎晚期至1龄幼虫期死亡（Liu等人，2014年），RNAi基因敲除为研究CdsA的时空需求提供了宝贵的机会（图s1b）。研究人员注意到tub-Gal4驱动的CdsA-RNAi幼虫（tub>CdsA-RNAi）可正常生长到3龄幼虫期，但不能蛹化（表1）。这些幼虫被产下后继续喂养并增长体重约20天，这表明它们在变态发育中存在缺陷。

变态发育是一个由类固醇激素蜕皮酮控制多器官的串扰过程。在幼虫到蛹的转化过程中，神经元促胸腺激素引发前胸腺中蜕皮激素的升高，并且通过蜕皮激素受体EcR在外周组织中释放的蜕皮激素作用于触发一组蜕皮激素反应基因的表达（Yamanaka等人，2013）。为了确定哪些组织里的变态发育需要CdsA，研究人员进行了组织特异性RNAi。泛神经元特异性elav-Gal4驱动的CdsA RNAi幼虫正常化蛹（表1），表明幼虫停滞表型没有神经元原因。同样，脂肪体特异性ppl-Gal4驱动的CdsA RNAi幼虫正常化蛹。然而，当研究人员用蛋白腺特异性2-286-Gal4敲除CdsA时，观察到与tub>CdsA-RNAi相同的幼虫停滞表型（图1b和表1）。用另外两种特异性促性腺Gal4系（P0206-Gal4和phm-Gal4）敲除CdsA，导致相同的幼虫停滞表型（表1）。前胸腺、黄体、心体紧密相连，形成环形腺。在产生保幼激素的黄体中，用Aug-21- Gal4敲除CdsA不会影响变态。因此，CdsA在前胸腺的特异性敲除足以阻止幼虫期向蛹期的转化，提示CdsA在前胸腺的蜕皮激素形成中起着重要作用。与此一致的是，CdsA位点的lac-Z染色显示CdsA在前胸腺中表达(图S1C)。

为了进一步检测2-286>CdsA RNAi幼虫蜕皮激素信号通路是否存在缺陷，研究人员通过定量RT-PCR检测了几种已知的蜕皮激素应答基因E74A、E74B E75B、BR-C、EcR和DHR3在幼虫发育过程中的表达水平。在对照中，E74A、E75B、BR-C和DHR3四个基因的转录水平在幼虫到蛹的转化过程中升高，蛹形成后下降(图S2)。在同一时间点，2-286>CdsA RNAi动物没有观察到这些变化，表明缺乏蜕皮酮反应(图S2)。另外，2-286>CdsA RNAi幼虫的滞育表型可以通过外供20E得到明显的挽救，2-286>CdsA RNAi幼虫中有50%以上在补充提供72 APF蜕皮酮时到发育成蛹（图1c）。此外，20E挽救的CdsA-RNAi成虫没有明显的形态异常（图1d）。总的来说，这些结果表明，CdsA在前胸腺中起作用，并需要适当的蜕皮激素信号。

接下来，研究人员试图确定CdsA RNAi幼虫变态缺陷的原因。由于2-286>CdsA RNAi导致前胸腺内脂质严重异位(图1E)，一种明显的可能性是2-286>CdsA RNAi前胸腺内脂质储存过多，损害了前胸腺细胞的正常功能。如果这是真的，基因操作导致类似的异位脂肪在前胸腺中储存可能会导致相同的幼虫停滞表型，而减少2-286>CdsA RNAi前胸腺的脂肪储存可能会挽救变态缺陷。然而，2-286> bbc RNAi或前胸腺腺特异性过表达的脂肪酶GPAT/CG5508、AGPAT/fu12、Lipin/CG8709或DGAT/mdy(图1A)并没有导致幼虫停滞表型(表1)，尽管它们都在前胸腺中表现出过量的脂质储存(图1E)。此外，过度表达bmm（编码哺乳动物ATGL的关键标记脂肪酶同系物）（Gronke等人，2005年），显著减少了2-286>CdsA RNAi引起的脂质过多储存，但不能挽救2-286>CdsA RNAi引起的幼虫停滞表型。（图1e和表1）。综上所述，这些结果清楚地表明，CdsA基因敲除的变态缺陷不是由于前胸腺中过多的脂质储存所致。

CdsA产生CDP-DAG，是PG和PI的前体。PIP2和PIP3这两种PI衍生物最有可能参与蜕皮激素信号传导和变态发育。研究人员之前发现，在CdsA RNAi幼虫中，PI和PIP3的总体水平显著降低（Liu等人，2014年）。PIP3对调节细胞生长的胰岛素途径活性至关重要。先前的研究表明，前胸腺细胞的大小对蜕皮甾体生成至关重要（Colombani等人，2005年）。PIP2水解产生IP3，通过激活IP3受体触发Ca²⁺释放，是囊泡介导的蜕皮激素分泌所必需的（Venkatesh和Hasan，1997年；Yamanaka等人，2015年）。研究人员用GFP报告分析CdsA RNAi前胸腺中PIP3和PIP2的水平。tGPH是PIP3的GFP报告基因，常用于监测胰岛素信号活动(Britton et al.， 2002)。与对照组细胞膜和细胞核的强GFP荧光相比，2-286>CdsA RNAi前胸腺的tGPH信号明显降低，表明PIP3水平降低(图S3A和B)。出乎意料的是，尽管PIP3报告基因水平降低，但对照组与CdsA RNAi的前胸腺细胞大小相似(图S3B)，这表明PIP3的降低不太可能是CdsA RNAi发生变态发育缺陷的原因。

随后，研究人员使用GFP报告和批量分析来监测PIP2的水平。发现，与对照组相比，2-286>CdsA RNAi幼虫的前胸腺质膜中的GFP信号明显较弱（图1f和g）。此外，尽管无法具体测量前胸腺中PIP2的水平，但在tub>CdsA RNAi中，总体PIP2水平显著降低（图1h）。综上所述，CdsA RNAi可能降低PI及其衍生物PIP2的水平，进而导致IP3信号降低引起蜕皮素胞外分泌异常和变态发育缺陷。

CdsA作为果蝇唯一的CDP二甘油酯合成酶，在胚胎发生过程中起着至关重要的作用(Liu et al.， 2014)。RNAi方法绕过了胚胎期的致死率，有助于阐明CdsA在不同阶段不同组织中的功能。由于CdsA在脂质稳态中的重要作用，CdsA的丢失已被证明会干扰脂质组成，包括PA含量的升高和PG、PI及其衍生物的减少。CdsA功能丧失导致不同组织或发育阶段的不同表型，这可能归因于这些脂质中一种或多种的变化。CdsA敲除幼虫的大脑、唾液腺、前胸腺、前胃和后肠中出现了强烈的脂质积累表型可能是由于PA含量的升高，（Liu等人，2014）。此外，幼虫唾液腺CdsA的下调严重降低了PI和PIP3的水平，进而影响胰岛素通路活性和唾液腺细胞大小(Liu et al.， 2014)。在成虫光感受器中，CdsA突变体表现出PA水平的升高和PIP2的耗尽，这会干扰横纹肌体的生物发生并导致严重的光依赖性光感受器退化（Wu等人，1995；Raghu等人，2009；）。CdsA耗损睾丸中PA的升高而不是PI的降低导致雄性不育表型，恢复正常PA水平对于挽救CdsA突变体中的精子发生缺陷至关重要(Laurinyecz et al.， 2016)。

胰岛素信号活性调节的前胸腺体大小对变态发育具有重要意义。不同于唾液腺，虽然研究人员观察到PIP3水平的降低，但CdsA RNAi中的前胸腺大小没有减小。这表明CdsA RNAi中PIP3的减少不太可能是导致变态发育缺陷的原因。由于CdsA的丢失显著降低了PIP2的水平，而它是IP3的前体，与IP3受体ITPR突变相似，原胸腺中CdsA缺失导致变态发育缺陷，可以被外源性蜕皮激素修复，研究人员认为CdsA RNAi的变态发育缺陷是由PIP2水平降低引起的。

如图，变态发育过程中需要脂质储存调控因子CdsA。