Cell：从代谢物到细胞命运：PPP驱动的皮层神经细胞命运转变新机制

为构建人类皮层发育图谱，研究人员对死后获取的发育期人类原代皮层组织（HPCT）进行了分离并建立原代培养体系，用于免疫荧光、能量代谢Seahorse检测、代谢组及代谢示踪分析。研究共纳入31例患者在不同发育阶段（DPs）的HPCT样本：神经形成与神经管闭合（DP1：孕周（GWs）6–9）、神经发生启动（DP2：GW 10–12）、神经发生高峰及祖细胞多样化（DP3：GW 13–15；DP4：GW 16–18）、神经元成熟（DP4–DP5：GW 19–20）以及胶质发生启动（DP4–DP5）。免疫荧光染色定量分析显示，细胞由DP1的GFAP⁺神经上皮细胞逐步向oRG、早期神经元，再到DP4-5阶段出现新生星形胶质细胞、成熟祖细胞、成熟神经元的命运转变。该体外细胞培养体系与已发表的人类发育皮层单细胞测序数据集高度吻合。

Seahorse分析显示各发育阶段代谢改变。在DP4阶段，细胞外酸化率（ECAR）升高且氧消耗率（OCR）/ECAR比值显著下降，表明该阶段对糖酵解的依赖性增强，而该特征无法仅通过细胞类型组成来完全解释。

利用HPCT体外培养构建不同阶段的代谢图谱

研究人员对体外培养的HPCT进行了LC-MS代谢组学分析及代谢示踪剂分析（使用¹³C₆-葡萄糖或¹³C₅-谷氨酰胺示踪剂），测定了涵盖15条代谢通路的126种代谢物。代谢组呈现发育阶段特异性动态改变。氨基酸类代谢物的丰度随发育阶段特异性波动，组氨酸、半胱氨酸及酵母氨酸持续升高，酵母氨酸在DP4阶段先升高后下降与神经元的扩张进程相吻合。S-腺苷甲硫氨酸（SAM）循环中的胱硫醚在DP2阶段至DP4阶段升高且与合成酶表达同步。脂肪酸在皮层发育后期积累，与先前将脂质积累与干细胞状态退出相关联的研究一致。稳态三羧酸（TCA）循环代谢物随发育年龄增加而降低，但同位素示踪显示后期阶段葡萄糖对TCA循环的贡献增强，表明代谢物丰度降低反映的是代谢周转加快而非通路活性下降。以上结果共同证明该代谢图谱是研究发育中人类皮层代谢的有效资源。

代谢组学揭示人类皮层发育中的动态通路变化

为了克服原代组织实验的局限性，研究人员构建了皮层类器官，并建立了与HPCT DPs时间点相匹配的代谢图谱。通过免疫荧光验证类器官皮层身份后，甲基化年龄分析和还原型谷胱甘肽（GSH）/ 氧化型谷胱甘肽（GSSG）证实了其与原代组织在发育进程和细胞健康状态上具有良好一致性。代谢组学比较显示，约80%的代谢物在HPCT与类器官中呈现相似动态变化或无明显差异，仍存在部分通路代谢物变化趋势完全相反。类器官与HPCT在糖酵解上游中间产物趋势一致，下游部分代谢物（磷酸甘油酸和丙酮酸）变化相反。类器官糖酵解代谢物总体随发育持续上升，HPCT则在DP4达到峰值。类器官在8、12周与对应HPCT阶段的糖酵解及TCA循环代谢特征一致，但15周时近半数TCA循环代谢物趋势反转。¹³C₆-葡萄糖示踪显示，类器官中糖酵解与TCA循环碳标记整体高于HPCT且随时间下降，而在HPCT中TCA示踪富集于DP4达到峰值，仅在DP4/12周这一对应时间点二者糖酵解与PPP途径的碳贡献相近，¹³C₅-谷氨酰胺标记结果进一步确认葡萄糖为各通路的主要碳源。

类器官重现了HPCT的关键代谢过程

在人类大脑皮层发育背景下，葡萄糖、细胞分化、细胞类型身份以及营养供给之间的关联尚未得到充分探究。研究人员设置不同葡萄糖浓度处理第5周皮层类器官（主要富含RG），并结合免疫荧光、单细胞核RNA测序（snRNA-seq）、Seahorse检测与代谢组学开展分析。结果显示低糖可改变细胞类型组成，造成深层神经元减少、星形胶质细胞及oRG数量增多，并伴随糖酵解抑制、TCA循环上调，PPP途径核心代谢物景天庚酮糖-7-磷酸（S7P）总水平下降但其¹³C₆-葡萄糖来源标记增强，表明S7P及PPP可能在低糖条件下细胞类型转变过程中发挥着重要作用。此外，低糖条件下核苷酸代谢发生重编程，而细胞整体氧化还原稳态（GSH/GSSG）未受明显影响。

PPP途径由两大分支组成：氧化分支生成NADPH——这是许多生物合成反应以及GSH/GSSG氧化还原循环的关键还原剂；而非氧化分支则参与核苷酸合成，通常为高增殖细胞提供所需的核苷酸。由于PPP途径与糖酵解途径的峰值出现时间在HPCT与类器官模型中高度吻合，研究人员进一步探究了PPP途径在RG细胞命运决定中的作用。通过药理学（药物靶向葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）或转酮酶（TKT））和遗传学（shRNA敲低G6PD或TKT）手段抑制PPP途径，均能模拟葡萄糖耗竭的效应，显著促进皮层类器官中RG向成熟命运转变：促进成熟神经元、星形胶质细胞和oRG以及背侧来源抑制性神经元的生成。代谢组学显示PPP代谢物（GSH、ATP、亚牛磺酸）减少和核苷酸比例改变；尽管遗传敲低诱发氧化应激而药物抑制无此效应，但两者在细胞类型变化及关键代谢物响应上高度一致。研究人员进一步通过CellTagging谱系追踪实验证实了所观察到的细胞类型变化是由于细胞命运转变所致，而不只是细胞存活差异带来的假象。

PPP调控RG的细胞命运决定

为了从机制上探究PPP抑制如何调控oRG命运，研究人员将TKT抑制剂ORX处理与代谢物补充相结合：补充维生素C和N-乙酰半胱氨酸以减轻氧化应激，补充核糖以恢复含核糖的中间产物，以及补充核糖核苷/脱氧核糖核苷以支持核苷酸生物合成。结果显示，核糖可显著回补oRG的转录组异常，逆转oRG及抑制性神经元比例升高的表型，抗氧化剂仅部分回补，核苷几乎无挽救效应；核糖能够恢复ATP、次牛磺酸及GSH/GSSG稳态，但未恢复PPP核心代谢物S7P；单独补充这些代谢物也可改变类器官代谢与细胞组成，提示人脑皮层对代谢物水平高度敏感。基于上述结果提出模型：由糖酵解供能的PPP抑制RG的成熟，并调控特定子代细胞分化。糖酵解和PPP代谢物在DP4阶段达到峰值，而PPP抑制会增加oRG和抑制性神经元的数量，且这种效应可被核糖补充所挽救。

综上所述，该研究利用原代组织和干细胞来源的皮层类器官，生成了早期人类皮层的代谢图谱，揭示了PPP在调控RG细胞命运决定中的关键作用，并为未来探索人类皮层发育中其他代谢通路提供了资源。