Cell Reports Methods：Sin Man Lam/税光厚团队建立多层级有机酸谱分析体系并揭示衰老过程中脂肪酰基分配的组织特异性变化

 用于检测有机酸谱的多层级工作流程描述了衰老过程中脂肪酰基分配的组织特异性变化 

2026年4月，中科脂典/江苏省代谢性疾病分子靶标与干预重点实验室的技术团队联合广州实验室、中国科学院遗传与生物发育学研究所、广州医科大学附属肿瘤医院的相关研究人员在《Cell Reports Methods》上发表了题为“A multi-tiered workflow for examining organic  acid profiles delineates tissue-specific changes  in fatty acyl partitioning during aging”的研究论文，构建了可在单个生物样本中全面测定脂肪酸完整谱图（包括酰基链长度C2-C34、酰基链不饱和度、位置异构体和内源性形式）以及参与糖酵解和三羧酸循环的有机酸的整合分析平台，并运用其揭示年轻与老年小鼠的大脑、视网膜（眼球）及骨骼肌中的脂肪酸重塑现象。

  亮点概述：

• 开发了一种方法来分析从C2到C34的脂肪酸。
• 提供了确定脂质物种之间脂肪酰基分配的工作流程。
• 衰老的糖酵解型肌肉会在甘油三酯（TGs）中积累奇数链脂肪酸。
• 衰老使骨骼肌中的油酸转变为甘油二酯而不是磷脂。

 研究背景：

有机酸是人类代谢组的重要组成部分，其中脂肪酸占比超过65%，既是维持细胞能量代谢的关键底物，也是甘油酯（中性脂质和磷脂）的核心组成部分。磷脂中的酯化脂肪酸可调节膜特性与流动性，而多不饱和脂肪酸的释放能产生调控生命过程的信号介质。然而，短链脂肪酸（SCFAs, C2-C6）、中链脂肪酸（MCFAs, C8-C14）、长链脂肪酸（LCFAs, C16-C20）和极长链脂肪酸（VLCFAs > C22）之间化学极性差异巨大，难以通过单次进样实现满意的色谱分离，给全面脂肪酸分析带来技术瓶颈。

现有研究多聚焦于偶数链和长链脂肪酸，但极长链脂肪酸和奇数链脂肪酸（OCFAs）的独特生物学功能日益受到关注。含极长链脂肪酸的神经酰胺会破坏膜完整性并触发坏死性凋亡，C28-C36 多不饱和脂肪酸在视网膜和大脑中发挥重要生理作用；队列研究也发现，血浆磷脂中酯化的奇数链脂肪酸水平与心血管疾病和2型糖尿病风险呈负相关。此外，脂肪酸的不饱和度、双键位置及内源性形式（游离态或酯化态）均显著影响其生理功能。

由于脂肪酸极性跨度大导致的色谱不兼容性，现有分析方法多局限于特定链长范围。尽管已有研究通过双衍生策略实现 C2-C24 脂肪酸的单次进样定量，但同时覆盖短链、长链及极长链（>C24）脂肪酸的整合方法仍属空白。

  研究结果：

研究人员设计的整合工作流程可在单次进样中全面定量内源性有机酸，包括C2-C34脂肪酸及糖酵解/三羧酸循环相关极性羧酸。根据研究需求，可结合另外两个分析层级：定量脂质组学，全面表征不同甘油酯类别中的酯化脂肪酸组成；碱性水解分析，定量样本中总脂肪酸（游离态+酯化态）水平。通过计算（总脂肪酸-游离脂肪酸）可获得酯化脂肪酸含量，进而分析各酯化脂肪酸在不同脂质类别中的分布比例，反映组织衰老过程中的脂肪酸重塑特征。

应用该工作流程分析6月龄（年轻）和23月龄（老年）雄性小鼠的大脑、眼球、腓肠肌和比目鱼肌组织，单一层级即可检测并定量116种独特有机酸，包括7种短链脂肪酸、6种中链脂肪酸、38种长链脂肪酸、50种极长链脂肪酸及15种极性羧酸。结合三层级分析，共定量540余种独特脂质及极性羧酸，全面覆盖脂肪酸的不同内源性形式。

多层级分析工作流程图

通过优化色谱梯度，该分析方法实现了极性羧酸及C2-C34脂肪酸的良好分离，峰形令人满意，疏水性更强的物质在保留时间较晚时洗脱。每个脂肪酸亚类的单个成员依次洗脱，而多不饱和脂肪酸（PUFAs）的ω-3和ω-6异构体（包括FA18:3、FA20:4和FA22:5）在当前梯度下实现了基线分离。此外，研究人员利用连续稀释的标品溶液，基于单个浓度下峰面积的最小二乘线性回归的标准响应误差（s）和回归系数（S），计算检测限（LOD=3.3s/S）和定量限（LOQ=10s/S），所有分析物LOD均<11 pmol，其中VLCFAs、LCFAs和MCFAs的检测灵敏度最优，部分化合物LOD达飞摩尔级。

单个有机酸的提取离子色谱图（XICs）

为验证该多层级方法在脂肪酸分区分析中的生物学实用性，研究人员用线粒体肉碱棕榈酰转移酶I（CPT-1）抑制剂依莫司汀处理 C2C12成肌细胞肌小管（CPT-1负责将长链酰基辅酶A转运至线粒体进行β- 氧化）。结果显示，依莫司汀处理后长链脂肪酸（C16:0、C16:1、C18:0、C18:1）向TGs的掺入显著增加，且呈浓度依赖性（80 µM > 40 µM）。此外，40 µM依莫司汀处理组中，酯化C16:0 向中短链TGs（C46-C50）的掺入显著降低，而向长链TGs（C>50）的掺入增加，表明CPT-1抑制阻碍了长链酰基辅酶A的β-氧化，使其优先进入长链TGs合成途径。同时，依莫司汀处理还降低了酯化C16:0和C18:0向多不饱和磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）的掺入。

使用依莫司汀处理成肌细胞肌小管的多层方法的体外验证

随后，研究人员应用该多层方法研究了年轻（6 月龄）和老年（23 月龄）C57BL/6N 雄性小鼠的大脑、眼球和骨骼肌中与衰老相关的脂质和有机酸谱变化。腓肠肌（Gas）主要由快缩糖酵解型（II 型）肌纤维组成，而比目鱼肌主要由慢缩氧化型（I 型）肌纤维组成。眼球与其他组织（如腓肠肌和大脑）共享的与衰老相关的代谢物数量最多。跨组织分析发现，双（单酰基甘油）磷酸酯（BMPs）在四种组织中均随衰老显著升高，印证了此前关于小鼠衰老过程中 BMPs 组织广泛性积累的研究结论，其积累可能与溶酶体活性增强相关。

多层方法研究组织有机酸谱中与衰老相关的重塑

值得注意的是，随着年龄的增长，观察到眼球和腓肠肌中包括FA17:2、FA17:1、FA19:2和FA19:1在内的酯化奇数链脂肪酸积累明显。老年小鼠眼球和腓肠肌中，酯化奇数链脂肪酸在TGs中的分布比例升高，表明衰老过程中酯化奇数链脂肪酸越来越多地定向到奇数链TGs中。事实上，老年小鼠的眼球和腓肠肌中TGs均显著积累。除奇数链脂肪酸外，老年小鼠眼球和腓肠肌中包括FA18:2、FA16:2和FA14:2在内的多种二不饱和脂肪酸的酯化水平也显著增加。此外，衰老小鼠眼球中，游离态和酯化态的极长链多不饱和脂肪酸（VLC-PUFAs）均显著降低，这种同步减少表明其向脂质膜的酯化过程未受衰老影响，减少可能源于膳食摄入变化、生物合成减弱或氧化应激/β-氧化增强导致的分解加速。

眼球中超长链多不饱和脂肪酸与年龄相关的减少

腓肠肌和比目鱼肌中，酯化FA18:1均随衰老显著积累，同时含FA18:1的磷脂酰肌醇（PIs）、PCs和DGs也同步升高。两种肌肉中 FA18:1 在 PI 36:3 (18:2_18:1) 中的分配无显著变化，但腓肠肌中FA18:1向DG 36:3 (18:2_18:1) 的分配随衰老轻微增加，表明衰老腓肠肌中过量的FA18:1优先进入DG合成途径而非磷脂酰肌醇。值得注意的是，氧化型的比目鱼肌中，含FA20:4的PEs显著积累，这一特征可能是比目鱼肌衰老速度慢于腓肠肌的重要原因。

氧化型（比目鱼肌）与糖酵解型（腓肠肌）骨骼肌有机酸谱的衰老相关变化

综上所述，该研究构建的多层级工作流通过体外依莫司汀处理肌管验证了有效性，并成功捕获了小鼠多种组织的衰老相关有机酸重塑特征。该方法有助于实现内源性有机酸谱的全面筛查，为评估有机酸稳态相关的能量代谢提供了有力工具。