Molecular Cell：组学解码CAD非经典功能：脱酰胺化修饰重塑代谢网络，驱动肿瘤增殖

代谢谱分析揭示嘧啶合成酶CAD是调控癌细胞增殖的中心碳代谢信号枢纽

2026年4月，美国南加州大学的相关研究人员在《Molecular Cell》（IF:16.6）上发表了题为“Metabolic profiling reveals pyrimidine synthesis enzyme CAD as a central carbon metabolism signaling node in cancer cell proliferation”的研究论文，揭示了嘧啶从头合成关键酶CAD通过脱酰胺化修饰激活关键糖酵解分支途径酶，从而重编程中心碳代谢，促进包括肝癌在内的肿瘤形成。为靶向CAD的非经典酶活性、开发新型抗肿瘤疗法提供了全新策略。

亮点概述：

1. CAD促进癌细胞增殖的作用不局限于嘧啶合成。
2. CAD通过脱酰胺化修饰并激活G6PD与PHGDH，重塑碳代谢网络。
3. CAD的谷氨酰胺酶结构域通过脱酰胺作用重编程碳代谢。
4. CAD激活的代谢重编程特征是人肝细胞癌（HCC）的基础。

研究背景：

癌细胞的快速增殖需要大量生物大分子的合成，代谢程序的核心是合成在细胞增殖中发挥多种功能的核苷酸。糖酵解及其分支途径，特别是戊糖磷酸途径（PPP）和丝氨酸合成途径（SSP），为核苷酸从头合成提供了碳源，而谷氨酰胺分解则为碱基提供了氮和碳。

氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶和二氢乳清酸酶（CAD）是一种三功能酶，该酶通过整合多种生理信号以调控嘧啶的合成从而支持细胞增殖。目前尚不清楚CAD介导的嘧啶合成如何与其他合成代谢途径相互作用，以协调细胞增殖过程中的大分子合成。

结果描述：

为探究CAD在癌症发生发展中的作用，研究人员通过shRNA在多种癌细胞系中敲低CAD并检测其增殖情况。结果显示，CAD敲低几乎完全抑制了乳腺癌、肝癌和肺癌细胞系的增殖。随后，选取对CAD敏感程度不同的三种细胞系，在裸鼠体内评估CAD敲低对癌细胞增殖的影响。同样发现，CAD敲低几乎完全抑制了所有受试癌细胞系在体内的成瘤能力。说明CAD对多数癌细胞的增殖至关重要。为确定CAD驱动癌细胞增殖是否仅依赖于经典的嘧啶合成活性，研究人员通过补充尿苷或二氢乳清酸（DHO）来恢复嘧啶库，发现补充尿苷和DHO仅能微弱地挽救CAD缺失细胞的增殖能力，而敲低另一个嘧啶合成关键酶UMPS后，补充尿苷能完全恢复细胞增殖。由此表明CAD在癌细胞增殖中存在独立于嘧啶合成之外的机制。

CAD在癌细胞增殖中不依赖于嘧啶合成的活性

在通过串联质谱（MS）鉴定与CAD相互作用的蛋白质实验中，研究人员特别关注到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）和磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH），且CAD与它们的相互作用在免疫共沉淀实验中得到证实。此外，体外酶活性检测发现CAD敲除降低了G6PD和PHGDH的酶活性。对CAD敲除的HepG2细胞的代谢物进行通路影响分析，结果显示CAD敲除显著改变嘌呤和嘧啶代谢、PPP、SSP和一碳代谢相关代谢物水平，这些变化与G6PD和PHGDH的活性改变相关。研究人员进一步利用[U-¹³C]葡萄糖对CAD敲除的HepG2和MCF7细胞进行同位素示踪，发现到PPP途径中6-磷酸葡萄糖酸（6PG，m+6）、核糖-5-磷酸/核酮糖-5-磷酸（R5P/Ru5P，m+5）以及SSP途径中丝氨酸（m+3）的同位素标记丰度显著下降，从而证实CAD可在增殖细胞中激活PPP和SSP。

CAD与G6PD和PHGDH相互作用，并激活PPP和SSP

CAD的脱酰胺作用可以显著改变靶蛋白的功能，表明其在健康与疾病中具有重要的生物学意义。为进一步揭示CAD激活G6PD和PHGDH的机制，研究人员利用二维凝胶电泳（2DGE）检测G6PD和PHGDH的电荷状态，发现在HepG2和MCF7细胞中敲低CAD后，它们在凝胶条带上向负电端迁移，表明CAD介导G6PD/PHGDH的脱酰胺化修饰。通过MS分析，研究人员鉴定出CAD分别介导G6PD在N153和Q161位点，PHGDH在Q439、Q446和N449位点发生脱酰胺修饰。随后，基于这些位点分别构建模拟脱酰胺化的突变体（G6PD-DE和PHGDH-EED）以及抗脱酰胺化的突变体（G6PD-AA和PHGDH-AAA）。体外酶活性检测与DSS交联实验发现，与野生型G6PD和PHGDH相比，G6PD-DE和PHGDH-EED表现出更高的酶活性和更强的二聚或寡聚体倾向，而G6PD-AA和PHGDH-AAA则效果相反。此外[U-¹³C]葡萄糖示踪分析发现，G6PD-DE显著增加了PPP的代谢通量，表现为6PG和NADPH水平升高；PHGDH-EED显著激活SSP通量，表现为丝氨酸和甘氨酸水平升高。且共同促进嘌呤核苷酸（肌苷酸，IMP）和嘧啶核苷酸（尿苷二磷酸，UDP）的从头合成，而抗脱酰胺化的突变体则降低了这些代谢物的水平。这些结果表明，脱酰胺化修饰可同时激活PPP中的G6PD和SSP中的PHGDH，从而促进NADPH生成、核苷酸从头合成以及丝氨酸下游代谢通路的活性。

CAD通过脱酰胺修饰激活PHGDH，从而上调SSP及一碳代谢

为探究CAD以不依赖嘧啶合成的方式驱动癌细胞增殖的机制，研究人员聚焦于CAD的谷氨酰胺酶（GLN）结构域的研究。发现在补充尿苷或DHO后，GLN仍能部分恢复CAD敲除细胞的增殖能力。2DGE和体外脱酰胺实验表明，外源表达的GLN可使G6PD和PHGDH向凝胶正极偏移，说明发生了脱酰胺化修饰。代谢组学分析的热图显示GLN升高了PPP和SSP的代谢物水平，如甘氨酸和R5P/Ru5P。[U-¹³C]葡萄糖示踪分析表明，GLN能增加6PG、R5P/Ru5P和丝氨酸的¹³C同位素丰度。表明CAD的GLN结构域能够激活G6PD和PHGDH，从而促进细胞增殖。进一步分析人类癌症数据库发现，约25%的癌症相关CAD突变富集于GLN结构域，其中S44F、F335S和E347Q等突变可进一步增强GLN的脱酰胺酶活性和驱动癌细胞增殖。这些结果共同揭示了CAD的GLN结构域激活增强了G6PD和PHGDH脱酰胺化修饰、从而促进细胞增殖的癌症相关突变。

CAD的GLN结构域通过脱酰胺修饰调控G6PD和PHGDH，并促进癌细胞增殖

最后，通过数据库分析和HCC患者组织样本检测发现，CAD蛋白和mRNA的高表达与HCC患者的不良预后显著相关。代谢组和免疫印迹分析表明，肿瘤组织中糖酵解中间产物积累、TCA循环代谢物水平降低、CAD表达与其pS1859磷酸化水平显著升高，同时G6PD和PHGDH脱酰胺化作用增强，最终证明CAD在HCC中被高度激活，并通过脱酰胺化作用激活G6PD和PHGDH等关键代谢酶，从而在HCC的发生发展中扮演重要的致病角色。