Nature Cell Biology：多组学揭示人血浆细胞外囊泡的核心蛋白质与脂质特征

2025年11月，澳大利亚贝克心脏与糖尿病研究所等单位的相关研究人员在《Nature Cell Biology》（IF: 19.5）上发表了题为“Multi-omics identify hallmark protein and lipid features of small extracellular vesicles circulating in human plasma”的研究论文，运用多组学方法，构建了血浆中细胞外囊泡（EVs）的蛋白质组合脂质组图谱，并提供了能够精确区分EV和非EV颗粒的生物标志物。

亮点概述：

首次通过多组学技术系统解析人血浆EV的核心蛋白组（182 种蛋白）和脂质组（52 种脂质）特征。
鉴定出42种非EV颗粒特异性蛋白和114种非EV颗粒特异性脂质，明确EV与非EV颗粒的分子差异。
ADAM10和 PS(36:1)与CE(18:0)的比例组合可作为人血浆中EV的高度保守和可靠的生物标志物。
开发开源网络工具，实现EV蛋白组和脂质组数据的便捷查询与分析，助力领域研究标准化。

研究背景：

EVs是细胞膜包裹形成的纳米级颗粒（直径 30-1000 nm），可释放到细胞外环境中，通过转运蛋白质、脂质、核酸和代谢物等生物活性物质介导细胞间通讯，在生理和病理过程中发挥多种功能。EVs广泛存在于人循环系统中，参与免疫调节、器官间串扰、组织稳态维持等关键生命过程，作为微创液体活检的潜在载体，EVs 在疾病诊断和治疗反应实时监测中具有重要应用前景。

尽管EVs的生物学和生物医学意义重大，但循环EVs的研究仍面临巨大挑战。血浆中存在大量非EV成分（如脂蛋白颗粒、可溶性蛋白、补体蛋白和免疫球蛋白），其数量比EVs高出6-7个数量级，这些成分易与EVs共纯化，导致质谱分析主要局限于高丰度血浆蛋白或脂蛋白相关脂质，难以获得完整、低覆盖度的数据。目前，国际EV领域正致力于开发和优化血浆EV分离方法，以精准定义其分子图谱。此外，源于细胞培养系统的现有EV标志物在人类样本中的保守性有限，需要明确人类循环EV的核心分子特征，为大规模人群研究、EV纯化与表征技术改进及国际EV研究指南完善提供支持。

研究团队首先采用高分辨率碘克沙醇密度梯度分离（DGS）技术从人血浆中分离小EVs，通过蛋白质印迹、低温电子显微镜、纳米颗粒追踪分析等多种生化和生物物理方法验证EV富集效果。结果显示，DGS 技术可将血浆中大部分高丰度成分（如白蛋白、载脂蛋白）分离至1-5组分，而EV标志性分子CD63则集中在6-8组分（浮力密度约 1.09 g/ml），该分辨率是单纯超速离心（p100K）无法实现的。分离得到的EV颗粒（pEVs）形态完整，为膜包裹的球形囊泡，平均直径 220.4 nm，尺寸范围 30-300 nm，呈净负电荷，与非EV颗粒（pDGS.LD）在形态和理化性质上存在显著差异。

为构建循环EVs的蛋白质组图谱，研究团队对38份人血浆样本的pEV进行质谱分析，并与 pDGS.LD、p100K和未处理血浆（统称 NonEVs，n=42）进行对比。在严格的肽段和蛋白质鉴定标准下（1% 假发现率），共量化pEV中的4631种蛋白质和 NonEV中的 1678 种蛋白质，pEV蛋白质组覆盖了低丰度循环蛋白，且与NonEV蛋白质组存在显著差异。通过出现频率分析和差异丰度分析，鉴定出259种在所有pEV样本中普遍量化的蛋白（1 类蛋白），其中182种蛋白在pEV中显著富集（称为pEV蛋白特征），这些蛋白主要富集于小EV相关通路（如肌动蛋白细胞骨架调控、内吞作用）和EV生物发生相关蛋白。同时，鉴定出42种非EV颗粒特异性蛋白特征，主要富集于补体和凝血通路及高丰度血浆蛋白。pEVs蛋白特征在已发表的循环EV蛋白质组和不同EV亚群（CD81⁺、CD63⁺、CD9⁺）中具有高度保守性，且在独立外部队列（AusDiab）中得到验证，177/182 种pEV蛋白特征被检测到，87.4%的pEV蛋白特征显著富集，显示出良好的可重复性。通过膜不透性生物素标记结合质谱分析，研究团队鉴定出151种pEV表面可及蛋白（包括 CD44、CD47、整合素家族成员等），构成循环 EV 的表面组，为基于抗体的 EV 捕获提供了靶点。此外，研究还发现pEV蛋白特征在冠状动脉钙化（CAC）患者和健康人群中均高度保守，同时能捕捉到疾病相关的蛋白表达变化，凸显其作为pEV研究参考标准的潜力。

绘制人血浆中循环EVs的核心蛋白质组

在脂质组分析方面，研究团队采用高通量靶向脂质组学平台，检测了3类脂质（糖鞘脂、鞘脂、固醇）中的40个脂质类别、829种脂质。主成分分析显示pEVs和NonEVs 的脂质组存在明显聚类分离，pEVs和体外EVs中高丰度脂质包括胆固醇（COH）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和鞘磷脂（SM），这些都是真核细胞膜的主要结构成分。超过30%的检测脂质 pEVs和NonEVs之间存在差异丰度，pEVs中富集的脂质（如二氢神经酰胺、三己糖神经酰胺、二己糖神经酰胺）与EV生物发生相关，且在体外EVs 中同样富集；而 NonEVs中富集的脂质（如胆固醇酯、甘油三酯、辅酶 Q10）主要是脂蛋白颗粒的成分。通过 K-均值聚类分析，鉴定出52种pEV脂质特征（c4簇）和114种非EV脂质特征（c1簇），pEV脂质特征在脂质本体论分析中与双层膜、质膜等EV相关术语富集，且在 DGS 6-7组分中高度富集，在独立队列和原代细胞来源EVs中也表现出良好的保守性和可重复性。

循环EVs的脂质组景观

研究人员进一步通过机器学习算法（朴素贝叶斯算法）验证，pEV和NonEV蛋白特征面板可区分pEV与非EV颗粒，准确率达100%；递归特征消除（RFE）分析发现 ADAM10是关键区分特征，其在pEVs和体外培养细胞来源EVs中特异性高表达，相对丰度可达样本中位数强度的7.5倍，可单独用于pEV与非EV颗粒的区分。此外，pEV和 NonEV脂质特征面板也可区分EV与非EV颗粒，准确率达97%；RFE 分析发现PS (36:1)（EV脂质特征）和 CE (18:0)（非EV脂质特征）是关键标记物。PS (36:1) 在 pEVs 和体外 EVs 中均为高丰度脂质，其与CE (18:0) 的相对丰度比可作为 EV 纯度评估的指标。