Nature: 钱友存/宋昕阳合作揭示载脂蛋白靶向共生菌调控肠道免疫新机制

2025年5月，中国科学院上海营养与健康研究所、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心等单位的相关研究人员在《Nature》（IF: 50.5）上发表了题为“Targeting symbionts by apolipoprotein L proteins modulates gut immunity”的研究论文，揭示了宿主诱导的因子如何通过选择性靶向共生神经酰胺分子来促进肠道免疫稳态。

亮点概述：

载脂蛋白L9a/b（APOL9a/b, APOL9）及人类同源蛋白APOL2可通过识别拟杆菌目细菌的神经酰胺-1-磷酸（Cer1P）脂质分子，实现对肠道共生菌的特异性靶向结合。
APOL9不直接杀伤细菌，而是诱导其释放外膜囊泡（OMVs），进而通过激活树突状细胞-TLR2信号通路，促进肠上皮细胞MHC-II表达及上皮内淋巴细胞稳态维持。
APOL9缺失会导致小鼠对肠道病原体感染的易感性增加，而补充 OMVs 可逆转这一缺陷。

研究背景：

哺乳动物肠道中的微生物与宿主共生。这些微生物促进营养吸收和代谢，并通过它们产生的各种代谢物或结构分子调控宿主免疫系统的发展。例如，微生物产生的短链脂肪酸或胆汁酸诱导结肠固有层中调节性T（Treg）细胞的分化，而微生物衍生的吲哚衍生物和亚油酸异构体促进小肠中CD4⁺CD8αα⁺上皮内淋巴细胞（IELs）的积累。微生物膜相关分子，如来自人类共生菌脆弱拟杆菌的多糖A和α-半乳糖神经酰胺，也已被证明分别对结肠Treg细胞和自然杀伤T细胞具有免疫调节活性。

肠道免疫系统通过复杂防御机制应对内源性菌群和入侵病原体的挑战。肠上皮屏障由糖基化黏蛋白形成凝胶状保护层，包含抗菌蛋白（AMPs）和分泌型抗体。近年研究发现，肠道淋巴滤泡相关基质细胞分泌补体成分C3至肠腔，用于细菌沉积和病原体清除。这些防御因子通过结合特定微生物类群（革兰氏阳性或阴性菌），维持宿主-微生物的共生关系，但其靶向特异性未表现出系统发育偏好性。因此，宿主能否选择性调控复杂微生物群落中的特定成员，及其对肠道免疫系统发育的影响，成为重要科学问题。

为了进一步了解宿主的肠黏膜屏障如何对微生物刺激做出反应，研究人员首先使用无标记定量蛋白质组学来鉴定宿主分泌因子，这些因子在缺乏微生物群的无菌（GF）小鼠回肠黏液中的水平发生了改变。同时，再从传统饲养（CR）的小鼠（无特定病原体（SPF））的回肠黏液中富集微生物群后，还通过蛋白质组学分析了微生物群的宿主结合因子。使用这种策略，共鉴定出219种在传统饲养的小鼠回肠黏膜层上调的蛋白质和244种黏附在这些小鼠回肠微生物群上的蛋白质。有7种蛋白质同时符合这两个标准，除了免疫球蛋白分子外，还注意到载脂蛋白L9a/b（APOL9a/b），两种未被鉴定的微生物群结合蛋白，也在CR小鼠的回肠黏液中富集。

为了分析APOL9a/b的微生物识别，研究人员纯化了重组APOL9a蛋白，并开发了一种基于流式细胞术/16S分类学的APOL9-seq策略，以评估APOL9a与复杂小鼠肠道微生物群的结合选择性。重组APOL9a蛋白显示出与拟杆菌目小鼠肠道共生菌结合的显著偏好。此外，人APOL1-APOL4在结构上与小鼠APOL9a/b同源，并在人肠细胞中表达，重组人APOL2可以像小鼠APOL9a/b一样有效地结合拟杆菌菌株。表明小鼠和人类肠道APOL分子都以保守的方式与微生物结合，并倾向于与肠道微生物组中的拟杆菌物种结合。

优势APOL蛋白结合共生菌的鉴定

拟杆菌的一个独特特征是它们能够使用与哺乳动物同源的丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）从头合成鞘脂，微生物鞘脂生物合成及其产物可能参与APOL9a结合。为了验证这一假设，研究人员为多形拟杆菌B.thetaiotaomicron中的鞘脂生物合成途径构建了一系列基因敲除菌株。发现敲除SPT或神经酰胺激酶（CerK，将神经酰胺生成神经酰胺-1-磷酸（Cer1P））基因，可完全消除APOL9a/b的结合能力，而敲除其他鞘脂合成基因（如PI-DHC合酶、MIP合酶）则无显著影响。脂质免疫沉淀-质谱分析显示，APOL9a 可直接结合拟杆菌细胞膜中的Cer1P分子，体外蛋白-脂质覆盖实验进一步证实，APOL9a/b和人类同源蛋白APOL2均能特异性识别Cer1P，而非其前体神经酰胺前体。因此，宿主APOL蛋白通过与Cer1P分子的直接相互作用与这种细菌结合。

APOL蛋白通过Cer1Ps与肠道共生杆菌结合

APOL家族成员已被证明具有膜成孔特性并介导细胞内病原体的清除，研究人员随后测试了APOL9对肠道内共生菌的体外杀菌活性，发现APOL9 在生理条件下可能对共生细菌没有强杀菌活性。然而，通过透射电子显微镜（TEM）观察到，在 APOL9a 孵育的多形拟杆菌中存在细菌膜起泡现象。这表明 APOL9a 沉积触发膜应激，随后增强这些细菌的外膜囊泡（OMV）产生。为了量化与小鼠 APOL9a/b或人类APOL2孵育时的OMVs释放，从多形拟杆菌培养上清液中收集OMV并在TEM下计数。结果表明，所有三种APOL蛋白都可以促进多形拟杆菌的OMV产生。然而，该菌中Cer1P合成的缺失阻止了APOL分子诱导的过量OMV产生。进一步研究表明，拟杆菌来源的OMVs可通过激活树突状细胞（DCs）表面的TLR2受体，触发MyD88依赖的信号通路，促进IELs分泌干扰素-γ（IFNγ）。IFNγ进一步作用于肠上皮细胞，诱导主要组织相容性复合体 Ⅱ 类分子（MHC-II）的表达，从而增强肠道上皮对抗原的呈递能力。

拟杆菌衍生的OMVs促进回肠肠道上皮细胞中MHC-II基因的表达

研究人员观察到，小鼠Apol9a/b的缺失不影响上皮内免疫细胞的一般组成。然而，回肠CD4⁺CD8αα⁺IEL以及这些IEL中的淋巴细胞特征基因表达显著降低。流式细胞术证实Apol9a/b的缺失导致回肠CD4⁺CD8αα⁺IEL水平降低，而其他IEL或固有层淋巴细胞（LPL）室的比例不受影响。回肠CD4⁺CD8αα⁺IEL已被证明具有细胞毒性和调节特性，对于维持肠道的免疫耐受和抗感染反应至关重要。因此，研究人员探究了APOL9a/b是否影响鼠伤寒沙门氏菌（STm）口腔感染模型中的肠道防御反应。结果表明，APOL9a/b既不直接结合并杀死STm，也不用于生物体的细胞内清除。然而，Apol9a/b缺失的小鼠表现出更高的死亡率，更严重的肠道炎症，以及更大的肠道细菌负荷和向非肠道器官的传播，而OMV给药改善了Apol9a/b缺失小鼠的STm感染。此外，研究人员没有观察到APOL9对缺乏拟杆菌的微生物群重组小鼠STm口腔感染的保护作用，也没有观察到对STm全身感染的保护效果。这些结果共同表明，APOL9a和APOL9b在肠道感染期间通过其在肠道中的免疫调节功能发挥保护作用。