Nature Metabolism：单细胞代谢筛选锁定Elovl1，推动实体瘤免疫治疗新突破

功能性单细胞代谢分析确定Elovl1是增强实体瘤中CD8⁺ T细胞适应性的靶点

2025年3月，比利时鲁汶大学等单位的研究人员在《Nature Metabolism》（IF:18.9）上发表了题为“A functional single-cell metabolic survey identifies Elovl1 as a target to enhance CD8⁺ T cell fitness in solid tumours”的研究论文，该研究为T细胞功能的代谢调节提供了新的见解，并为提高癌症免疫治疗的疗效提供了一种潜在方法。

亮点概述：

极长链脂肪酸蛋白1（Elovl1）是维持CD8⁺ T细胞效应功能和记忆表型的关键代谢靶点。
Elovl1缺陷的T细胞中饱和长链脂肪酸（VLCFAs）的减少介导了INSIG1的不稳定性和SREBP2的激活，使T细胞激活和增殖得到改善。
Elovl1缺陷通过增强线粒体功能和脂肪酸氧化，帮助T细胞抵御肿瘤微环境的代谢压力。

研究背景：

免疫疗法在过去几十年中彻底改变了癌症治疗。免疫检查点阻断（ICB）药物，如针对程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、程序性死亡配体1（PD-L1）或细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）的抗体（分别为抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4），旨在重新激活肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞。这些药物在黑色素瘤、肾癌和肺癌的亚群患者中实现了长期的高响应率，但在如胰腺导管腺癌（PDAC）这样的免疫“冷”肿瘤中几乎未显示出临床益处。同样地，过继性T细胞转移（ACT）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在治疗血癌方面取得了惊人的成功，但在治疗实体瘤（尤其是PDAC）上效果一般。

癌症免疫疗法常常效果不佳，因为实体肿瘤的微环境具有敌对性，营养限制、乳酸介导的酸化和缺氧等因素共同抑制了CD8⁺ T细胞的浸润和抗肿瘤活性。由于CD8⁺ T细胞的活性和分化受到不同代谢程序的调控，以往的研究集中于癌症和T细胞代谢，试图揭示可以作为新治疗靶点的脆弱性。反过来，使用免疫检查点抑制剂抗PD-1治疗也会促进T细胞的代谢重编程。然而，如何调节CD8⁺ T细胞的代谢，使其对抗PD-1治疗敏感并增强其在实体肿瘤中的效应功能，在很大程度上仍然是未知的。

首先，为了识别免疫学“冷”肿瘤对免疫疗法反应的代谢决定因素，研究人员开发了一种临床相关的PDAC模型，该模型将KPC细胞系原位注射到免疫活性小鼠的胰腺头部，又将这些KPC细胞进行改造，使其组成性表达鸡卵清蛋白（OVA），称为KPC_OVA。通过ACT激活的OVA特异性CD8⁺ T细胞（OT-I），无论是野生型（sgNT）还是PD-1基因敲除（sgPdcd1），在植入KPC_OVA细胞后的第5天进行验证，进一步证实了基于T细胞和免疫检查点的治疗耐药性。数据表明，即使在阻断PD-1–PD-L1免疫抑制轴的情况下，肿瘤微环境中也存在额外的免疫抑制信号以限制CD8⁺ T细胞活性，从而为在体内对CD8⁺ T细胞进行代谢筛选提供了一个代表性的模型。

此外，为了确定在免疫治疗下哪些代谢途径抑制了PDAC中CD8⁺ T细胞的浸润，研究人员对2,078个参与细胞代谢的基因进行了CRISPR敲除筛选。该方法鉴定出了83个基因在至少一个器官和治疗条件下显著富集，再利用基因本体论（GO）通路分析这83个基因中特别富集的代谢途径，结果显示脂质和小分子代谢以及有机物质生物合成是最具代表性的生物过程。总之，这些分析验证了体内多器官CD8⁺ T细胞代谢筛选，并突出了83个抑制T细胞在肿瘤和淋巴微环境中积累的代谢基因。

体内CRISPR筛选鉴定肿瘤和转移器官中调节CD8+ T细胞适应性的代谢基因

为了优先筛选出最具治疗潜力的靶点，研究人员将CRISPR筛选与单细胞RNA测序相结合(CROP-seq)，重点关注原发肿瘤微环境，分析表明在筛选出的83个基因中成功富集了与抗PD-1产生协同抑制的候选基因。下一步，研究人员从PDAC原发肿瘤中分选了经过小向导RNA（sgRNA）转导的CD90.1⁺ OT-I细胞，并对其进行单细胞水平的转录组和sgRNA表达分析。通过聚类分析发现了七种不同的CD8⁺ T细胞表型，且这些表型在抗PD-1治疗的小鼠中发生了显著变化，表现为效应型T细胞增加，而前体耗竭表型T细胞减少。

接下来，研究人员根据CD8⁺ T细胞的表型对不同的基因敲除进行排序，以确定那些在抗PD-1治疗后显示出持续增殖、更强细胞毒性、更好记忆性和更低耗竭性的靶点。结果发现编码极长链脂肪酸延长蛋白1的Elovl1基因在前体耗竭T细胞簇中排名第一，表明该方法在识别具有系统相关性并与抗PD-1治疗协同作用的潜在靶点方面的效率。此外，研究发现Elovl1主要在高度增殖的T细胞中表达，这些细胞需要大量脂质来维持膜的生成和细胞器的生物合成，因此会上调脂质合成途径。为进一步验证该靶点的临床相关性，研究人员对来自PDAC或黑色素瘤患者的人类单细胞测序数据集中的CD8⁺ 肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）进行了相同分析，发现增殖的CD8⁺ TILs也是ELOVL1表达最高的簇，与小鼠模型的结果一致。这些数据共同强调了Elovl1是一个具有很强转化潜力的相关代谢靶点。

体内单细胞CRISPR筛选将Elovl1选为维持CD8⁺ T细胞活性的有前景的代谢靶点

ELOVL1是七种能够延长极长链脂肪酸（VLCFAs）的酶之一。ELOVL1与ELOVL3和ELOVL7一起，生成饱和和单不饱和的VLCFAs，而ELOVL2和ELOVL5则生成多不饱和的VLCFAs。考虑到其在脂肪酸延伸中的作用，研究人员通过脂质组学评估了体外激活的CD8⁺ T细胞（转染sgNT或sgElovl1（Elovl1基因被删除））的脂质组成。结果观察到含有22至26个碳原子（C₂₂-C₂₆）VLCFAs的脂质减少，而含有较短脂肪酸链（C₁₆-C₁₈）的脂质增加，从而在功能上验证了Elovl1的缺陷。脂质组学分析还显示，与对照CD8⁺ T细胞相比，sgElovl1细胞膜微结构域的重要成分（包括鞘磷脂、神经酰胺和总胆固醇）有所增加。其中，细胞膜的游离胆固醇的升高尤为引人注目，因为此前的研究表明这与更强的T细胞受体信号传导以及肿瘤内CD8⁺ T细胞更强的效应表型相关。为了评估sgElovl1 CD8⁺ T细胞是否也增加了细胞膜中的胆固醇，于是研究人员使用探针进行检测，发现Elovl1缺陷型CD8⁺ T细胞膜胆固醇水平升高，细胞膜流动性降低，而在接受抗PD-1治疗的小鼠的KPC_OVA肿瘤中浸润的sgElovl1 CD8⁺ T细胞中，游离胆固醇的增加也得以维持。这部分实验表明Elovl1的缺失导致大多数脂质种类中VLCFAs的掺入减少，并导致游离胆固醇积累。

Elovl1缺陷的CD8⁺ T细胞表现出脂质代谢重编程和胆固醇水平升高

为了更好地理解Elovl1缺失对CD8⁺ T细胞中哪些通路产生了影响，研究人员分析了体外RNA测序数据，结果显示，与sgNT CD8⁺ T细胞相比，胆固醇生物合成是 sgElovl1 CD8⁺ T细胞中上调最为显著的生物学过程之一。在CD8⁺ T细胞以及其他细胞类型中，固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）是调控这些通路的主要转录因子。SREBP2的激活始于胰岛素诱导基因1（INSIG1）的降解，这使得SREBP2和其裂解激活蛋白（SCAP）复合物能够从内质网转运到高尔基体。在高尔基体中，蛋白酶切割SREBP2，导致其核转位。通过免疫印迹分析检测了INSIG1蛋白水平，发现与对照组细胞相比，Elovl1基因缺失后的24h内，CD8⁺ T细胞的INSIG1水平显著降低。向Elovl1缺陷型T细胞中补充二十四烷酸（C24:0）可以阻止INSIG1的降解，表明饱和VLCFAs在哺乳动物中也参与调控INSIG1。最后，为了证实VLCFAs和胆固醇在Elovl1缺陷型CD8⁺T细胞表型调节中的直接作用，研究人员在KPC_OVA荷瘤小鼠中进行ACT实验，使用经过C24:0或洛伐他汀预处理的sgElovl1 OT-I T细胞，并对其进行抗PD-1治疗。C24:0或洛伐他汀的预处理阻止了Elovl1缺失介导的对肿瘤生长控制的有益效果。这部分研究表明饱和VLCFAs有助于稳定INSIG1，防止胆固醇积累，并阻碍CD8⁺ T细胞的功能。

VLCFA减少介导INSIG1不稳定性和SREBP2激活

Elovl1缺失增强了CD8⁺ T细胞的线粒体功能，表现为线粒体形态更长、体积更大、碎片化减少，呼吸链复合物增加，氧消耗率提高。这些变化在体内外实验中均得到验证，表明Elovl1缺失通过改善线粒体功能增强了T细胞的抗肿瘤活性。考虑到Elovl1抑制引起的脂质和代谢重编程，研究人员接下来利用全标的¹³C-葡萄糖和棕榈酸分别全面表征葡萄糖和脂肪酸代谢。结果发现，Elovl1缺失增加了葡萄糖向柠檬酸的掺入。在细胞质中，柠檬酸可以通过ATP柠檬酸裂解酶转化为乙酰辅酶A，为胆固醇合成提供原料。此外，葡萄糖来源的三羧酸（TCA）循环中间体α-酮戊二酸、琥珀酸和苹果酸的水平降低，而甲羟戊酸水平增加。与葡萄糖不同的是，¹³C-棕榈酸来源的柠檬酸和α-酮戊二酸在sgElovl1 T细胞中均比对照组更丰富，表明棕榈酸来源的TCA循环中间体被保留在线粒体中。这些结果共同证明，Elovl1缺失的CD8⁺ T细胞通过氧化葡萄糖来维持细胞质中的胆固醇合成，并利用棕榈酸补充TCA循环中间体。这部分数据共同表明，Elovl1抑制介导了深刻的代谢重编程，并且促使T细胞更倾向于分化为记忆样表型。