Nature Communications：孙永华团队揭示肠道DHA-PA-PG轴促进母源脂质利用和消化器官扩张的新机制

2024年11月，中国科学院水生生物研究所孙永华团队在《Nature Communications》(IF:14.7)上发表了题为“Intestinal DHA-PA-PG axis promotes digestive organ expansion by mediating usage of maternally deposited yolk lipids”的研究论文。该研究利用斑马鱼模型，发现肠道中DHA-PA（磷脂酸）-PG（磷脂酰甘油）轴调控母源脂质的利用并促进消化器官扩张，从而揭示了DHA在胚胎发育中以一种新机制发挥作用。

亮点概述：

原始肠道具有长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）合成和磷脂（PL）代谢的功能。
DHA-PA-PG轴在原始肠道中调控卵黄脂质的高效利用，对胚胎发育至关重要。
DHA-PA-PG轴的破坏激活原始肠道铁死亡信号通路，从而阻碍消化器官的扩张。

研究背景：

卵生动物的早期胚胎发育主要依赖于卵黄囊中储存的物质，即卵黄物质。卵黄物质形成于卵母细胞的发育阶段，因此也被称为母源物质，其主要包括母源RNA、蛋白质、脂质等。在胚胎发育期间，母源物质直接或者间接地被发育中的胚胎所利用。有关母源RNA或蛋白质调控胚胎早期发育，已经有相当多的研究；但是母源脂质如何被胚胎发育所有效利用并调控胚胎发育，其作用机制仍不清晰。

作为卵生动物的代表，鱼类在开口摄食之前的胚胎发育完全依赖于母源的卵黄物质及其代谢产物，是研究母源脂质调控胚胎发育的良好模型；另一方面，在养殖鱼类繁育实践中，卵黄能否被有效吸收利用，仔鱼能否正常开口摄食，实现胚胎从内源营养到外源营养的过渡，是影响胚胎孵化率、鱼苗成活率和养殖效益的瓶颈要素。因此，利用斑马鱼模型开展胚胎“内源-外源营养转换（endogenous-to-exogenous nutrient source transition, eeNST）”机制研究，有着重要的理论意义和应用价值。

脂质的吸收和利用对胚胎发育至关重要。为了探讨eeNST转换前胚胎的脂质动态变化，研究人员分析了Fraher等人已发表的数据。结果显示，躯体中磷脂（phospholipids，PL）含量逐渐增加，而卵黄中PL含量逐渐减少，揭示了胚胎发育过程中PL的动态变化。对Gao Y等人已发表的斑马鱼5 dpf（受精第五天）胚胎的肝脏和原始肠道RNA-seq数据进行分析，发现肝脏较原始肠道高量表达的基因富集到甘油脂代谢通路，而肠道较肝脏高量表达的基因富集到磷脂代谢通路。这些结果揭示，原始肠道的磷脂代谢可能在胚胎发育中发挥了重要作用。

长链多不饱和脂肪酸（long-chain polyunsaturated fatty acids，LC-PUFAs）作为PL重塑的底物。研究人员分析了与LC-PUFA合成相关的基因在原始肠道和肝脏中的转录水平，结果显示hsd17b12a在原始肠道中高量表达。随后，研究人员利用近期建立的CRISPR/Cas9与iPGC诱导相结合的基因敲入技术构建了myc蛋白标签和mCherry基因标记的hsd17b12a基因敲入品系，发现Hsd17b12a在原始肠道上皮细胞中特异性表达，且脂肪酸延长所需的其他酶编码基因也在肠道上皮细胞中特异表达，这提示原始肠道具备脂肪酸延长的能力。进一步，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了hsd17b12a敲除品系，发现该基因缺失导致原始肠道的LC-PUFA合成缺陷，鱼鳔充气障碍，导致胚胎无法顺利度过eeNST转换，最终全部死亡。

hsd17b12a的缺失导致LC-PUFA合成缺陷和胚胎致死

鉴于hsd17b12a在原始肠道中的特异性表达，并且其突变导致由内胚层发育而来的鱼鳔不充气，研究人员进一步探讨了这一突变是否影响其他内胚层器官的发育。通过RNA-seq分析，比较了突变体和野生型（WT）胚胎在3和4 dpf时的基因表达。结果显示，4 dpf时外分泌胰腺和肝脏标记基因在突变体中显著下调，揭示外分泌胰腺和肝脏的扩张受阻。随后，研究人员通过胚胎原位杂交技术和荧光标记外分泌胰腺和肝脏的转基因品系，验证了突变体外分泌胰腺和肝脏扩张受损的现象。通过转基因过表达hsd17b12a促使突变体外分泌胰腺和肝脏正常扩张，进一步证实了原始肠道LC-PUFA合成缺陷导致了消化器官扩张缺陷。

hsd17b12a突变体导致消化器官扩张缺陷

斑马鱼等脊椎动物无法从头合成LC-PUFAs，必须依赖膳食中的亚油酸（linoleic acid，LA)和α-亚麻酸（α-linolenic acid，ALA）通过脂肪酸延伸途径实现LC-PUFAs的生物合成。对于斑马鱼而言，卵黄是唯一的营养物质来源。因此，研究人员进一步探讨了突变体躯体和卵黄中甘油三脂（triglyceride，TAG）和游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）的动态变化，结果发现卵黄中的脂质出现堆积，主要由于卵黄脂质未能有效运输至原始肠道。这些结果揭示了原始肠道LC-PUFA合成在调控卵黄脂质利用中的重要作用。

Hsd17b12a促进卵黄脂的吸收和利用

为了阐明hsd17b12a突变体中原始肠道卵黄脂质吸收和利用受损的机制，研究人员对原始肠道形态进行了详细分析。结果发现，突变体中原始肠道的皱褶度、厚度以及微绒毛的长度显著减少。此外，肠道上皮细胞紧密连接在肠道屏障和功能中起着重要作用，而突变体中肠道紧密连接的形成存在缺陷。通过全身转基因过表达hsd17b12a拯救突变体原始肠道缺陷。综上，这些结果表明hsd17b12a突变体导致卵黄脂质吸收和利用受损的主要原因是原始肠道功能缺陷。

hsd17b12a突变导致原始肠道缺陷

为了探讨消化器官发育缺陷的分子机制，研究人员对突变体和WT胚胎进行了RNA-seq分析。结果显示，hsd17b12a突变体中铁死亡信号通路被激活。通过单细胞数据分析，进一步确认这一信号通路的激活发生在原始肠道中。铁死亡依赖于铁离子，并由脂质过氧化引发。研究人员通过一系列实验发现，促进铁死亡的活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、亚铁离子（Fe²⁺）含量是增加，且acsl4b的转录水平上调；同时，抑制铁死亡的GPX4蛋白含量减少。这些结果揭示了原始肠道中铁死亡的发生。通过抑制铁死亡信号通路，可以部分拯救内胚层器官扩张和卵黄吸收缺陷，这表明原始肠道的铁死亡是内胚层器官扩张受阻的重要原因。

铁死亡导致消化器官扩张缺陷

为了研究hsd17b12a突变是否会影响原始肠道的细胞命运，研究人员对肠道细胞进行聚类分析。原始肠道细胞类型占比分析结果显示，在突变体中hsd17b2a阳性的肠上皮细胞（enterocytes）增加；hsd17b2a阳性的肠上皮细胞（intestinal epithelial cells）减少，而这群细胞具有甘油磷脂代谢的功能。研究结果揭示，hsd17b12a可能通过调控原始肠道LC-PUFA合成来调节肠道细胞分化，从而影响原始肠道的脂质代谢。为了进一步探讨原始肠道脂质代谢在消化器官扩张缺陷及铁死亡的作用机制，研究人员对hsd17b12a突变体和WT胚胎进行了脂质组学分析，结果发现原始肠道中存在一条DHA-PA-PG代谢轴。通过一系列拯救实验，研究人员发现DHA-PA-PG轴受损是肠道铁死亡和消化器官扩张受阻的重要原因。