Cell：脂质化ApoE-受体相互作用减少为阿尔兹海默症的关键保护机制

载脂蛋白E（APOE）基因型是迟发性阿尔茨海默症（LOAD）最显著的遗传修饰因子，相对于更常见的APOE3等位基因，APOE4和APOE2等位基因分别显著增加和降低疾病风险。ApoE是大脑中最丰富的载脂蛋白，主要由星形胶质细胞和反应性小胶质细胞表达，调节胆固醇代谢。研究表明，在一系列AD模型和患者的大脑中存在胆固醇失调，脂质是AD发病机制的核心。LOAD中ApoE亚型依赖的脂质代谢失调的确切分子机制尚不清楚。

基于配体竞争分析，ApoE2与低密度脂蛋白受体（LDLR）的结合存在缺陷是最显著的ApoE亚型特异性生化特征之一。先前的研究共性使得研究人员推测，脂质化ApoE（lipApoE）与LDLR结合的减少可能是降低AD风险的一种机制。

LDLR是lipApoE的关键受体。由于需要ApoE脂质化才能暴露其LDLR结合位点，研究人员使用1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）将HEK293细胞衍生的ApoE脂质化并评估了ApoE-LDLR的结合情况，结果显示lipApoE3和lipApoE4的细胞表面信号很稳定，而lipApoE2的细胞表面信号最小，表明lipApoE2与LDLR的结合减少。随后，研究人员定量测量lipApoE与LDLR细胞外结构域的结合并评估了LDLR结合对lipApoE内化的影响，证实了LDLR对ApoE的细胞摄取是亚型依赖性的。

接下来，研究人员探究了LDLR介导的lipApoE摄取是否影响LDLR的再循环，结果发现在H4、WT HAP1和APOE KO iPSC（多能干细胞）衍生的星形胶质细胞中，与lipApoE2相比，与lipApoE3/E4孵育的细胞会显著降低表面LDLR水平，这表明LDLR循环受损，同时LDLR介导的lipApoE摄取增加。随后研究人员通过免疫染色查看了LDLR的细胞分布，并用荧光标记的LDL培养血清饥饿的H4细胞研究LDL的摄取情况。这些结果表明LDLR介导的lipApoE3/E4摄取增加，加上LDLR在内化时从lipApoE的解离效率低下，导致细胞表面LDLR重新分布到内溶酶体，从而加剧了竞争性结合对LDL摄取的抑制。

由于中枢神经系统（CNS）脂蛋白是高密度脂蛋白（HDL）样，研究人员测试了ApoE亚型是否能以不同方式介导细胞对pHrodo标记的HDL的摄取，pHrodo是一种pH敏感染料，在酸性内溶酶体中发出荧光。pHrodo HDL与ApoE亚型的预络合促进了其对ApoE4>ApoE3>ApoE2的摄取。LDLR ECD抑制了ApoE3或ApoE4对pHrodo-HDL的摄取，表明LDLR在ApoE介导的HDL内化中发挥了关键作用。已有研究表明在AD大脑和AD模型中，CE（胆固醇酯）水平均有升高。研究人员进一步发现ApoE亚型和LDLR依赖性调节CE摄取。随后，研究人员使用CE（18：1）/HDL/ApoE复合物处理APOE KO iPSC衍生的星形胶质细胞并进行脂质组学分析。不同链长的CE、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）与长链多不饱和脂肪酸（PUFAs）和甘油三酯（TGs）的差异最为显著，表现出ApoE≥ApoE3>ApoE2的变化趋势。与ApoE2相比，经ApoE3或ApoE4 处理后的细胞CE（18：1）显著升高，表明外源性CE的亚型依赖性摄取。与无ApoE对照相比，ApoE2处理降低了大多数CE种类，这表明ApoE2的胆固醇外排作用超过了其脂质摄取功能，导致胆固醇负担总体降低。

ApoE亚型和LDLR依赖性脂质摄取影响脂质稳态

脂质包括胆固醇，可以诱导小胶质细胞的促炎反应。研究人员测试了ApoE亚型依赖的脂质负荷是否对iPSC来源的小胶质细胞（iMg）的炎症反应产生不同的影响。结果表明脂质负荷增加确实促进了炎症反应。ApoE3和ApoE4诱导的CE摄取相似，但后者导致多种细胞因子的分泌显著增加。除了参与胆固醇稳态基因显著差异外，ApoE亚型显著调节的其他途径包括氧化磷酸化、真核翻译延伸/起始和干扰素（IFN）反应。与ApoE3处理相比，ApoE4处理对氧化磷酸化和IFN反应途径的上调作用更弱。

考虑到CE（20：4）是人血浆中最丰富的CE物种之一，研究人员测量了人脑脊液（CSF）样本中的CE（20：4）水平，发现与年龄匹配的对照组相比，AD患者的CE（20：4）升高。由于PUFAs容易过氧化，可能促进神经元脂褐素的形成，这是一种溶酶体病理学，是衰老的标志。研究人员在iPSC衍生神经元（iNeurons）细胞中发现携带 CE（20：4）的ApoE亚型差异诱导脂褐素的积累，并在小鼠大脑中进行了验证，海马内注射 PUFA-CE-lipApoE4 足以诱导野生型小鼠的脂褐素病变。

携带PUFA-CE的ApoE亚型在培养细胞中差异诱导脂褐素

研究人员进一步在Tau/E4小鼠中探究CE（20：4）-lipApoE4是否影响过表达P301S tau的iNeurons中的脂质。脂质组学分析发现，与其他亚型相比，用CE(20:4)-lipApoE4处理后，多种脂质种类发生了显著变化。除了CE（20：4）本身的显著增加外，多个含PUFA的TGs（如TG（20：4_34：2））和缩醛磷脂（如PE（P-16：0/20：4））以及PE也显著升高。几种甘油二酯（DGs）和鞘脂亚类，包括鞘磷脂（SMs）、神经酰胺（Cer）和己糖基神经酰胺（HexCer），表现出显著减少，表明ApoE4增强的脂褐质沉积症伴随着广泛的脂质失调。越来越多的证据表明ApoE4促进AD大脑中tau病理的扩散。研究人员研究了PUFA-CE-lipApoE4增强的脂褐素对tau纤维原神经元积累的影响与因果关系，结果表明脂褐素增加了tau纤维原的溶酶体积累，并在APOE4小鼠脑中升高，并因tau病理而恶化。与ApoE2类似，Christchurch（R136S）突变在常染色体显性AD病例和AD小鼠模型中具有保护作用。研究人员发现Christchurch突变也减少了LDLR的结合并降低脂质负荷。

总之，该研究结果表明，ApoE及其携带的脂质（包括PUFA-CE）在内溶酶体的无节制递送是致病的，而抑制CNS中lipApoE与受体的相互作用可能会降低LOAD风险或疾病进展。lipApoE4可以被修饰为类似于保护性变体表型，这可能为开发新型疗法提供新见解。