Molecular Cell：何康敏团队和方晓红团队合作揭示PI3K-PI(3,4,5)P3-AKT信号时空调控的新机制

2024年11月，中科院遗传发育研究所、中科院杭州医学研究所、中科脂典等相关单位的研究人员在《Molecular Cell》（IF：14.5）发表了题为“Spatial organization of PI3K-PI(3,4,5)P₃-AKT signaling by focal adhesions”的研究论文，揭示了哺乳动物细胞中PI3K-PI(3,4,5)P₃-AKT信号传导与生长因子无关的、区室化的组织机制。

亮点概述：

IA类PI3Ks优先被招募到局灶性粘附（FA）处进行激活。
PI(3,4,5)P₃在FA周围生成并富集。
AKT1通过PI(3,4,5)P₃在FA周围动态募集。
FAK调控PI3K-PI(3,4,5)P₃-AKT信号的空间组织。

研究背景：

I类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT信号通路是细胞存活、生长和增殖的关键调控因子，也是癌症中最常发生突变的通路之一。PI3Ks是由p110催化亚基（IA类p110α、p110β或p110δ和IB类p110γ）和调节亚基p85或类p85组成的脂质激酶。I类PI3K的空间招募决定了PI3K-AKT信号在何处以及如何被激活和调控。然而，可视化内源性I类PI3K在哺乳动物细胞中的动态空间靶向仍然具有挑战性。

PIK3CA和PTEN在癌症中经常发生突变，它们分别调节关键信号脂质PI(3,4,5)P₃的产生和降解。PI(3,4,5)P₃通过招募和激活包括AKT在内的效应蛋白，发挥关键信号传导作用。然而，在基础或生理条件下，I类PI3K、PI(3,4,5)P₃和AKT在细胞中被招募/激活的精确亚细胞区室仍然尚不清楚。

研究人员首先通过荧光蛋白mNeonGreen在人乳腺癌SUM159细胞中标记内源性催化亚基p110α来确定I类PI3K在活细胞中的动态亚细胞定位。局灶性粘附（FA）是与质膜相关的大分子集合体，是感知和传导细胞外生化和物理线索的信号枢纽。由于p110α的结构模式与FAs相似，研究人员对表达FA标记物mCherry-FAK的p110α- mNeonGreen^+/-细胞进行了单分子成像，结果表明p110α被优先招募到FAs。研究人员进一步发现去除p110α与p85 iSH2结构域相互作用N端适配器结合结构域，可以阻止p110α招募到FAs和质膜。同时p85α和p85β的敲除也损害了p110α的募集，表明p85是p110α招募所必需的。通过对表达mEGFP-p85α^+/+的细胞进行成像分析，发现FAs是IA类PI3K的首选亚细胞室。通过生成同时表达p110α-mNeonGreen^+/-和Halo-p85α^+/+的细胞系的成像分析，结果表明p110α-p85α复合物从细胞质招募到FAs。

内源性p110α和p85α被动态地、优先地招募到FAs中

研究人员进一步探究PI(3,4,5)P₃是否在基础条件下细胞的FAs空间中产生。Btk PH-TH模块被广泛用于监测激动剂刺激细胞中PI(3,4,5)P₃的升高，研究人员生成了与荧光标记融合的PI(3,4,5)P₃生物传感器2xBtk(2-166)。通过该PI(3,4,5)P₃传感器的低水平表达，研究人员在TIRF显微镜中观察到PI(3,4,5)P₃在SUM159细胞质膜多个区域的动态富集，同样在其他癌细胞系中也观察到这一现象。

接下来，研究人员研究了PI(3,4,5)P₃传感器在局部富集是否与FAs有关，发现在SUM159细胞、T47D细胞以及其他细胞系中均观察到局部富集的PI(3,4,5)P₃传感器与荧光蛋白mCherry-FAK标记的FAs之间存在密切的空间和时间相关性。并且PI(3,4,5)P₃传感器与多种类型的细胞膜粘附结构相关联。为了进一步分析IA类PI3K招募与PI(3,4,5)P₃生成之间的时空关系，研究人员监测了内源性p110α和PI(3,4,5)P₃传感器对单个FAs的招募。几乎所有的FAs都显示了p110α的招募，但PI(3,4,5)P₃优先富集在FAs的一个子集中。研究人员随后在不同细胞状态下证实了IA类PI3K空间靶向机制在细胞基础和刺激条件下有所不同。

PI(3,4,5)P3在FA周围生成并富集

PI(3,4,5)P₃通过招募和激活包括AKT在内的效应蛋白，发挥关键的信号传导作用。研究人员进一步研究了PI(3,4,5)P₃的效应蛋白AKT，结果表明IA类PI3K优先招募到FAs中，导致局部PI(3,4,5)P₃的生成，导致AKT1的区域化招募。FAK作为整合素介导的信号转导的中心中介，在细胞粘附和各种细胞外刺激过程中，FAK会随着整合素-细胞外基质（ECM）结合时被激活。研究人员使用FAK抑制剂地法替尼探究了FAK在PI3K-PI(3,4,5)P₃-AKT信号传导中的作用，发现PI(3,4,5)P₃的生成与FAs和FAK的激活相关。FAK的激活始于酪氨酸397（Y397）的磷酸化。先前的研究表明，p85在哺乳动物细胞裂解液中与FAK免疫沉淀依赖于Y397在FAK上的磷酸化。研究人员通过免疫共沉淀分析证实了细胞中FAK和p85a在细胞中的关联，抑制FAK磷酸化降低了这种相互作用。随着PI(3,4,5)P₃生成的减少，FAK抑制剂也减少了AKT1向质膜的募集。在FAK抑制剂处理过的细胞中，AKT的磷酸化水平也降低了。这些结果表明IA类PI3K招募、PI(3,4,5)P₃生成和AKT招募/激活受激活FAK的调控。

FAK调节IA类PI3K招募、PI(3,4,5)P3生成和AKT激活

SUM159细胞在p110α中携带一个杂合子H1047L激活突变（PIK3CA^WT/H1047L）。为了探讨该致癌突变对PI(3,4,5)P₃生成和分布的影响，研究人员生成了两个基因编辑的SUM159细胞系H1047L（PIK3CA^{H1047L/H1047L}）和另一个H1047纯合子（PIK3CA^WT/WT）。PIK3CA^WT/WT细胞中AKT的磷酸化水平远低于杂合的或纯合的H1047L突变的细胞。质谱分析证实，与PIK3CA^WT/WT细胞相比，PIK3CA^{H1047L/H1047L}和PIK3CA^WT/H1047L细胞的PI(3,4,5)P₃水平升高。PI(3,4,5)P₃去磷酸化可以通过PTEN或SHIP1/2发生。PTEN的敲除导致了整个细胞表面的PI(3,4,5)P₃水平的增加，同时削弱了其区域化分布。研究人员进一步观察了突变细胞中AKT的分布，结果表明IA类PI3K和PTEN共同调控PI(3,4,5)P₃的空间生成和分布，从而导致AKT的招募/激活。最后，研究人员探究了FAK调控PI3K-PI(3,4,5)P₃-AKT信号通路在癌症治疗中的作用，发现FAK和p110α联合抑制对乳腺癌SUM159细胞的侵袭性有较强的抑制作用。