Cell Metabolism：税光厚/郑明华/王福生合作揭示MASLD纤维化脂质生物标志物及脂蛋白硫苷酯的潜在功能

2024年11月，中国科学院遗传与发育生物学研究所、中科脂典、温州医科大学附属第一医院、中国人民解放军总医院第五医学中心等单位的相关研究人员在《Cell Metabolism》（IF: 27.7）上发表了题为“Non-invasive lipid panel of MASLD fibrosis transition underscores the role of lipoprotein sulfatides in hepatic immunomodulation”的研究论文，评估了血浆脂质组在区分轻度纤维化和非纤维化MASLD患者中的诊断效用，并报道了在MASLD纤维化中，低密度脂蛋白（LDLs）上的硫苷酯（SLs）可通过激活不同的循环免疫细胞群来调节肝脏炎症级联反应。中国科学院遗传与发育生物学研究所税光厚研究员、温州医科大学附属第一医院郑明华主任、中国人民解放军总医院第五医学中心王福生院士为本论文的通讯作者。中科脂典技术总监Sin Man Lam (林茜雯）博士、中科院遗传发育所王泽华博士、博士生石悦、解放军总医院第五医学中心宋锦文副研究员、温州医科大学附属第一医院内分泌科主治医师刘文悦博士为该论文的共同第一作者。

亮点概述：

发现可用于诊断轻、中度MASLD纤维化的非侵入性血液标志物。
血液中的SLs作为核心脂质与MASLD纤维化显著相关。
在纤维化起始阶段，血液中的低密度脂蛋白（LDLs）和高密度脂蛋白（HDLs）之间的SLs的分配出现异常。
LDL-SLs可能调节 II 型自然杀伤 T 淋巴细胞的活化。

研究背景:

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD），也称为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），其渐进和无症状的过程在很大程度上排除了早期发现和干预的机会。目前评估MASLD的临床参考标准要求进行活检，这既昂贵又具有侵入性和危险性。此外，肝活检只能对肝脏病理进行非线性和半定量评估，这限制了灵敏度和准确性，尤其是在细微的生物变化的情况下。因此，迫切需要开发用于MASLD进展的有效诊断、分期和监测的微创工具。

MASLD的表型定义为肝脏甘油三酯过量积聚，包括从脂肪变性（非酒精性脂肪肝，NAFL）到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的疾病状态转变，其特征是随着纤维化的发展，肝细胞气球状突起和小叶炎症，最终发展为肝硬化和肝细胞癌。肝纤维化被确定为与死亡率和肝移植的长期不良结果相关的关键组织学特征。此外，显著的肝纤维化是进展为肝硬化的主要指标。

鉴于肝纤维化对MASLD临床结果的决定性作用，已经开发了非侵入性检测，如NAFLD纤维化评分（NFS），用于识别晚期纤维化（≥F3），但这些检测在区分较轻纤维化方面表现出较差的性能。此外，现有的检测大多集中在直接或间接反映肝功能的特定生物分子上，这些生物分子无法提供对阐明潜在治疗靶点很重要的病理学相关分子变化信息。系统级组学研究为揭示循环代谢产物和肝脏失调之间的新关联提供了一个有吸引力的解决方案，以揭示更多的干预靶点。

研究人员选择影像学证实的肝脂肪变性和/或血清转氨酶水平持续升高并伴有代谢危险因素的患者进行肝活检。只有经组织学证实的MASLD患者被纳入研究。519名MASLD参与者最终被招募到本研究中，包括195名非纤维化患者和324名纤维化患者。与非纤维化患者相比，纤维化患者的体重指数（BMI）明显较高，血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平升高。

研究人员对空腹血清样本进行全面定量的靶向定量脂质组学和甾醇组学（即甾醇和氧化甾醇）分析，以解读MASLD背景下与肝脏病理学不同方面（即纤维化、脂肪变性和炎症）相关的血脂。

研究设计

研究人员使用组学和临床数据训练了lasso回归模型，用以区分Kleiner 评分(F0-F4)定义的轻至中度纤维化（≥F1；其中92%参与者介于 F1-F2）和非纤维化（F=0）MASLD 患者。分别基于临床变量、脂质变量以及临床和脂质变量的组合为模型构建单独的受试者工作曲线（ROCs）。DeLong检验用于比较不同模型之间的统计学意义。一个由15种脂质和5个临床变量组成的小组将纤维化与非纤维化MASLD患者分开，受试者工作曲线下面积（AUROC）为0.775 (95% CI: 0.735-0.816)。“临床+脂质”组的表现明显优于单独的临床组，且F1得分和平衡准确性令人满意。按FDR升序排列的前30种脂质的森林图显示，与非纤维化相比，血液中的SLs（30个中的11种）在MASLD纤维化中减少，与Kleiner纤维化评分呈负相关，与NAFLD活性评分（NAS）和个体NAS成分评分均无显著相关性。

用于鉴别MASLD患者轻中度肝纤维化的非侵入性脂质组

接着，研究人员对血清脂质组进行了limma分析，以确定与肝纤维化明显相关的脂质。构建的三个模型（模型协变量见下图）中，由26种脂质组成的小组始终具有统计学意义（FDR<0.05），其中许多与构成使用lasso回归模型生成的区分轻度至中度MASLD纤维化的血清脂质组的候选脂质重叠，证明了这些脂质组成对肝纤维化具有病理特异性。值得注意的是，SLs占这些脂质的三分之一以上（10/26），且与脂肪变性和炎症没有显著相关性，这表明血液中SLs的变化与纤维化的发生是独特相关的。

为了探究肝脏病理学和肝脏SL水平之间的相互作用，研究人员对从具有不同Kleiner分级的MASLD患者获得的肝脏活检组织进行了蛋白质组学和脂质组学整合分析。使用Reactome通路数据对与肝脏SL水平显著相关的蛋白质进行过度表达分析(ORA ),揭示了SREBP介导的基因表达调控的改变。事实上，在MASLD纤维化中，与从头脂肪生成有关的SREBP-1靶基因的蛋白质水平，以及参与胆固醇生物合成的SREBP-2靶基因的蛋白质水平都显著降低。此外，GDP-岩藻糖生物合成途径的富集提示MASLD纤维化过程中岩藻糖基化异常。GDP-岩藻糖转运蛋白1(SLC35C1)蛋白水平在纤维化中显著升高，而岩藻糖基转移酶水平无明显变化。因此，对上游鞘脂前体底物的竞争可能是MASLD纤维化中肝脏SLs减少的原因，而SREBP-1信号减弱导致的脂肪生成减少预计将进一步限制肝脏SLs生物合成前体底物的可用性。

血液中的SLs在MASLD纤维化中明显减少

随后，研究人员使用多尺度嵌入式相关网络分析病理改变的脂质协同调节，发现与非纤维化相比，MASLD纤维化中不饱和甘油二酯（DAGs）和系统甘油三酯（TAG）谱之间的协同调节减弱，这些不饱和的DAGs也是纤维化中最显著改变的血脂之一。此外，植物甾醇和SLs在非纤维化中的正协同调节个在纤维化中丢失。血液中植物甾醇优先分布在高密度脂蛋白（HDL）上，纤维化中脂蛋白亚组分中SLs的分布可能发生了改变。

纤维化性与非纤维性MASLD血脂的差异相关分析

为了了解纤维化发作是否会使血液中SLs在脂蛋白类别中的分布发生偏斜，研究人员接下来探究了患有或不患有肝纤维化的MASLD患者的脂蛋白-脂质谱。相关性分析表明，在MASLD纤维化中，血清SLs表现出从HDLs向低密度脂蛋白（LDLs）的重新分布。与其他脂蛋白相比，LDL-SLs的水平随着纤维化而最低限度地降低。因此，在MASLD纤维化中，从肝脏释放到血液中的极低密度脂蛋白（VLDL）SLs优先重新分布到LDLs上，而不是HDLs上。

为了阐明血液中SLs在MASLD背景下触发肝纤维化的分子作用，研究人员对从MASLD患者采集的成对血清和肝活检样本中的脂质和蛋白质组数据进行了跨组学整合。KEGG“磷酸戊糖途径（PPP）”和“补体和凝血级联”作为与血清SLs显著相关的肝脏蛋白的ORA分析的富集途径出现。血清SLs与属于PPP途径的肝酶水平呈正相关，但与肝补体蛋白呈负相关。SLs是首次鉴定的II型自然杀伤T淋巴细胞（II型NKTs）的脂质抗原。NKTs对抗原呈递细胞在分化簇1d（CD1d）上呈递的脂质抗原作出反应，从而将脂质代谢与系统免疫桥接。先前的研究已经证明了血液中的脂蛋白通过特定的脂质成分触发NKT激活的免疫能力。研究人员接着探究含有不同量SLs的脂蛋白组分对从人外周血单核细胞（PBMCs）分离的免疫细胞群活化的影响。结果显示，与HDLs和游离未结合SLs相比，用患者LDLs处理的PBMCs中II型NKTs的百分比增加。重要的是，与对照LDLs相比，含有较少SLs的MASLD患者的LDLs对II型NKT的激活显著降低。表明在MASLD纤维化中，LDLs引发II型NKTs特异性的免疫调节功能。

脂蛋白硫苷脂调节II型NKT效应器功能

VLDLs是LDLs的直接代谢前体。在VLDLs的脂解性重塑过程中，过量的表面脂质和蛋白质成分可能与HDLs有关。因此，VLDLs的代谢命运改变了LDLs和HDLs的丰度和组成。研究人员观察到，与非纤维化患者相比，纤维化患者的VLDLs中TAG含量显著下降。ORA分析揭示了MASLD纤维化下VLDL组成和/或分泌改变的分子决定因素。Reactome途径“转运到高尔基体和随后的修饰”、“ER到高尔基体的顺行转运”和“COPI介导的顺行转运”特别令人感兴趣，因为新生VLDL颗粒从ER到高尔基体的转运对调节VLDL成熟和肝脏分泌至关重要。肝脏分泌相关Ras相关GTPase 1B蛋白（SAR1b）水平在MASLD纤维化中降低，该蛋白负责新生VLDLs从ER到高尔基体的转运，以形成富含TAG的VLDLs。此外，HDLs的几种主要载脂蛋白成分，包括APOA1、APOA2和APOA4，以及介导肝细胞中新生HDLs组装的磷脂转运ATP酶（ABCA1），在MASLD纤维化中显著增加。