Advanced Science：武宁/曾筑天/税光厚等合作揭示TMEM16F保护宿主免受李斯特菌感染的细胞和分子机制
2024年8月，华中科技大学、中国科学技术大学、中科院遗传发育所等相关单位的研究人员在《Advanced Science》（IF: 14.3）发表了题为“TMEM16F Expressed in Kupffer Cells Regulates Liver Inflammation and Metabolism to Protect Against Listeria Monocytogenes”的研究论文，揭示了库普弗细胞表达的TMEM16F通过炎症及代谢调节对细菌病原体感染的保护作用及相关机制。
亮点概述：
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TMEM16F在肝库普弗细胞（KCs）中表达，但在T细胞或B细胞中不表达，是体内预防李斯特菌的关键。
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缺乏TMEM16F的情况下，李斯特菌在体内诱导质膜破裂和KCs破碎。
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KC死亡与更大的肝脏损伤、炎症变化和肝脏代谢失调相关。
研究背景：
细菌病原体感染是全球死亡的主要原因，公共卫生的首要任务是减轻因感染造成的死亡负担。李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是第二大威胁死亡的食源性细菌病原体，每年导致约15000人死亡。Lm通常通过胃肠道进入，并通过血液传播到远端部位，导致全身感染。微生物经常通过产生可损害质膜（PM）的成孔毒素（PFT）来伤害细胞，例如Lm相关的李斯特菌溶血素O（LLO）。Lm感染中未愈合的PM会导致含有Lm的膜突起，通常表现出外翻的磷脂酰丝氨酸（PS），并且LLO介导的膜损伤的有效修复需要细胞外Ca2+，这表明脂质紊乱过程发生在PM受伤部位。
Ca2+激活的脂质搅乱酶TMEM16F属于TMEM16家族，由10个具有氯离子通道和/或搅乱酶活性的旁系同源物组成。TMEM16F参与多种生理或病理过程，例如胚胎发育过程中的凝血、骨矿化、滋养层融合以及SARS-CoV-2感染过程中的合胞体形成。所有小鼠细胞类型中缺乏TMEM16F都会导致Lm引发的肝损伤增加。然而，尚未确定负责这种保护作用的细胞类型和机制。
为了研究在Lm感染过程中TMEM16F保护哪些免疫细胞抵抗细胞裂解，研究人员将小鼠脾细胞与Lm共培养。在缺乏TMEM16F的情况下，几乎所有免疫细胞（包括脾巨噬细胞）在Lm感染后表现出细胞死亡增加，CD8+ T细胞除外。为了揭示TMEM16F在对抗Lm诱导的细胞死亡中的分子机制，研究人员使用基于逆转录病毒的系统恢复RMA TMEM16F缺陷细胞中的TMEM16F表达。离子霉素处理后，TMEM16F的重新表达使TMEM16F KO细胞能够外翻PS。同时，TMEM16F表达的恢复显著恢复Lm感染后RMA TMEM16F KO细胞的脂质紊乱，导致PS暴露而不是细胞死亡。这些数据支持TMEM16F在Lm感染期间以细胞固有方式保持PM完整性的作用。
TMEM16F介导的脂质紊乱抵消Lm诱导的细胞死亡
为了全面了解由TMEM16F依赖的脂质紊乱调节的特异性脂质，研究人员通过质谱（MS）对离子霉素和LLO处理的胸腺细胞纯化的质膜样品进行脂质组学分析。来自WT和TMEM16F KO胸腺细胞的未刺激样本显示出高度相似的脂质谱，表明TMEM16F在激活前对PM脂质的影响很小。鉴于TMEM16F是一种真正的磷脂重组酶，研究人员尝试确定在Lm感染期间脂质是否直接受到TMEM16F的影响。细胞感染Lm后，除了PS外，磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）和磷脂酰乙醇胺（PE）在PM的内层和外层之间被TMEM16F扰乱，分别由NBD-PC、NBD-SM和杜拉霉素染色显示。这些发现表明，在Lm感染期间，TMEM16F对质膜脂质进行广泛重组并通过改变PM的流动性来保持PM的完整性。
TMEM16F对Lm感染的广泛质膜脂质重组反应
为了进一步表征Lm感染后肝脏的变化，研究人员对感染3天的WT和TMEM16F KO小鼠的肝脏样本进行RNA测序。主成分分析（PCA）显示未感染的WT和TMEM16F肝脏中的转录组几乎相同，但在感染后存在显著差异。与WT小鼠相比，TMEM16F KO小鼠在感染后表现出明显更高数量的差异表达基因。GO分析表明，在TMEM16F缺失的情况下，大多数上调基因与免疫反应相关，而下调基因则与细胞代谢有关。此外，基因集富集分析（GSEA）揭示各种代谢过程中的富集途径，包括脂质、氨基酸和激素，表明在感染后缺乏TMEM16F的情况下，受损肝脏中细胞代谢发生系统性改变。值得注意的是，与脂质代谢相关的基因在TMEM16F KO小鼠中主要下调。研究人员通过脂质组学分析Lm感染后的脂质谱。尽管个体小鼠之间存在相当大的差异，但依旧能观察到TMEM16F KO小鼠肝脏中甘油二酯（DAG）和甘油三酯（TAG）增加，以及特定磷脂（PLs）和胆固醇酯（CE）的变化。因此，转录组结果支持Lm感染后TMEM16F KO小鼠细菌滴度升高引起过度炎症反应，可能导致肝脏代谢失调并加剧肝损伤。
TMEM16F缺乏导致肝脏对Lm感染的过度促炎反应和脂质代谢失调
肝脏驻留巨噬细胞，也称为库普弗细胞（KC），被确定为Lm感染早期的主要宿主细胞。为了进一步阐明TMEM16F在细菌感染过程中KCs的作用，研究人员采用活体显微镜观察体内Lm感染的动态。在感染后12h，与WT小鼠相比，TMEM16F KO小鼠肝脏中的细菌负荷更多。这与TMEM16F KO小鼠肝脏中KCs数量的显著减少相伴随，表明TMEM16F可能在防止KC死亡方面发挥关键作用，从而限制这些吞噬细胞的Lm逃避。随后，研究人员对小鼠肝脏进行实时成像，TMEM16F KO小鼠中Lm感染的KCs经常表现出强烈的膜破裂和破碎，导致细胞内细菌的快速扩散。研究人员通过核酸染料碘化丙啶（PI）来进一步评估Lm感染的KCs的PM完整性，在PI注射后的最初2h内，一些TMEM16F缺陷的KCs（而非WT KCs）通过突然发射红色荧光表现出PI染色。感染后48h，TMEM16F KO小鼠的肝脏中存在明显更多的感染。
体内TMEM16F缺乏导致Lm感染期间KCs质膜破裂和碎片
综上所述，该研究发现库普弗细胞中表达的TMEM16F对于保护宿主免受李斯特菌感染至关重要。这种影响与库普弗细胞表达的TMEM16F预防过度炎症和肝脏代谢异常的能力有关。
