Nature Communications：王魁/蒋静文团队联合揭示FBXO7泛素化PRMT1抑制肝癌丝氨酸合成和肿瘤生长

• FBXO7通过泛素化降解下调肝癌细胞中的PRMT1。

• FBXO7介导肝癌细胞PRMT1在37位点赖氨酸的泛素化。

• FBXO7通过下调肝癌细胞PRMT1抑制丝氨酸合成，诱导氧化应激。

  研究背景：

为了保持生存和持续增殖，癌细胞通常会重编程代谢模式，以满足其高合成代谢需求，并在癌症进展过程中维持氧化还原平衡。其中，丝氨酸从头合成途径是糖酵解代谢的关键代谢旁路，在许多癌细胞中经常被过度激活。丝氨酸的生物合成始于糖酵解中间体3-磷酸甘油酸（3-PG），在第一限速酶磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）催化下转化为3-磷酸羟基丙酮酸（3-PHP），并继续进行两个酶促反应生成丝氨酸。丝氨酸可以被丝氨酸羟甲基转移酶1/2 (SHMT1/2)催化生成甘氨酸。

蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）介导的蛋白精氨酸甲基化已成为癌症发病过程中常见且重要的翻译后蛋白修饰。PRMT1是一种I型蛋白精氨酸甲基转移酶，可催化各种底物的单甲基化和不对称二甲基化。据报道，PRMT1蛋白水平在肝细胞癌（HCC）中上调以促进肿瘤发展，其高水平与HCC患者的不良临床预后相关。最近发现 PRMT1 蛋白水平异常增高会使磷酸甘油脱氢酶（PHGDH）甲基化并增强其催化活性，从而促进丝氨酸合成、减轻氧化应激并促进 HCC 生长。然而，PRMT1在癌症中的上调机制仍然知之甚少。

F-box蛋白7（FBXO7）是SCF（SKP1/cullin-1/F-box蛋白）型E3泛素连接酶，属于cullin-RING连接酶（CRLs）家族。最近的研究表明，FBXO7在肺癌、结肠癌和子宫内膜癌等多种癌症中表达异常。然而，FBXO7是否在HCC中发挥作用尚不清楚。

为了确定PRMT1降解的关键E3泛素连接酶，研究人员基于不同数据库筛选及非标记定量蛋白质组学分析，发现只有FBXO7是与PRMT1相互作用候选物中唯一的E3连接酶。接着通过免疫共沉淀（Co-IP）实验、荧光共定位实验和GST pulldown实验证实了FBXO7与PRMT1之间存在相互作用。然后再通过表达GFP-PRMT1和FLAG-FBXO7的不同截短突变体联合Co-IP分析，发现PRMT1与FBXO7结合需要PRMT1的催化结构域（23-162aa），FBXO7与PRMT1结合需要FBXO7的泛素样结构域（UBL，1-78aa）和FBXO7-PI31二聚化结构域（FP，181-324aa）。总的来说，这些数据表明FBXO7直接与PRMT1相互作用。

FBXO7与PRMT1相互作用

E3 泛素连接酶 FBXO7 与 PRMT1 之间的相互作用使研究人员推测并验证了FBXO7 通过泛素-蛋白酶体降解降低了PRMT1蛋白水平。接着为了鉴定PRMT1的泛素化位点，对泛素化的FLAG-PRMT1进行免疫沉淀，并进行LC-MS/MS分析。4个赖氨酸残基（K37，K82，K202，K325）被鉴定为PRMT1潜在的泛素化位点。然后将这些赖氨酸残基突变为精氨酸（K37R，K82R，K202R，K325R），并进行体内泛素化实验，发现除K37R以外的其余突变体都观察到PRMT1泛素化的增加。此外，与PRMT1-WT相比，PRMT1-K37R突变体表现出更长的半衰期。敲低FBXO7能显著增加PRMT1-WT的半衰期，但对K37R突变体的半衰期无明显影响。综上所述，这些数据表明K37是FBXO7介导PRMT1的一个主要泛素化位点。

FBXO7介导肝癌细胞PRMT1在37位点赖氨酸的泛素化

PHGDH 是丝氨酸从头合成途径中的限速酶，研究团队前期发现RPMT1通过精氨酸甲基化修饰增强PHGDH活性（Nat Commun. 2023, doi: 10.1038/s41467-023-36708-5）。在此基础上，研究人员发现FBXO7可通过下调PRMT1并抑制PHGDH精氨酸甲基化和活性。随后，研究人员通过检测无丝氨酸/甘氨酸（-SG）培养基培养的HCC细胞中的总丝氨酸和甘氨酸水平来评估FBXO7是否影响丝氨酸的合成。在Huh7和 PLC/PRF/5细胞中FBXO7 KD会导致细胞内丝氨酸和甘氨酸水平的明显增加，而PRMT1 KD则会阻抑这种增加。然而，当在PRMT1 KD细胞中过表达FBXO7时，无法观察到丝氨酸和甘氨酸水平的进一步降低。为了进一步证实这些观察结果，研究人员使用U-[¹³C]-葡萄糖来追踪丝氨酸和甘氨酸的从头合成。结果显示，FLAG-FBXO7的强烈表达显著减少了葡萄糖中¹³C与丝氨酸和甘氨酸的结合，而过表达PRMT1 K37R突变体（而非PRMT1 WT）可以挽救这种情况。这些数据表明，FBXO7通过下调PRMT1抑制丝氨酸的合成。

丝氨酸合成途径通过生成GSH和NADPH作为其下游产物，在维持氧化还原稳态中发挥着关键作用。因此，研究人员探索了FBXO7是否通过下调PRMT1参与调节氧化还原平衡。结果表明丝氨酸/甘氨酸缺失（-SG）导致Huh7和PLC/PRF/5细胞中还原型谷胱甘肽（GSH）水平、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH/ NADP⁺）比值明显下降。FBXO7 KD细胞中GSH和NADPH生成的增加导致活性氧（ROS）水平显著降低。此外，引入K37R突变体而非野生型PRMT1会显著影响FBXO7过表达细胞中ROS水平的增加。此外，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可明显减少丝氨酸/甘氨酸饥饿时FBXO7过表达细胞中ROS的积累。总之，这些数据表明，FBXO7通过下调PRMT1抑制HCC细胞中丝氨酸的合成并诱导氧化应激。

FBXO7通过下调肝癌细胞PRMT1抑制丝氨酸合成诱导氧化应激

研究人员进一步确定FBXO7介导的PRMT1负调控在HCC生长中的作用，发现与对照细胞相比，PRMT1 KD细胞的生长受到抑制，FBXO7 KD导致对照细胞的生长增加，但在PRMT1 KD细胞中没有。然后，研究人员通过将含有或不含PRMT1 KD的FBXO7 KD Huh7细胞皮下注射到以对照组（+SG）或无丝氨酸/甘氨酸组（-SG）饮食喂养的裸鼠体内，建立小鼠异种移植模型。研究发现，PRMT1 KD都抑制了以+SG和-SG饮食喂养的小鼠的肿瘤异种移植的生长，肿瘤大小、体积和重量都相应减少，而FBXO7 KD导致肿瘤生长明显增加。为了进一步证实这些观察结果，研究人员向裸鼠皮下注射了过表达FLAG-FBXO7和GFP-PRMT1-WT或K37R的Huh7细胞，结果表明，FLAG-FBXO7过表达抑制了以+SG食物喂养的小鼠异种移植的生长。当小鼠以-SG食物喂养时，肿瘤大小和重量进一步减少。PRMT1-K37R突变体能明显恢复FLAG-FBXO7对肿瘤生长的抑制作用，而PRMT1-WT则不能。这些结果表明FBXO7可通过下调PRMT1来抑制PHGDH甲基化和HCC生长。

最后，研究人员分析了FBXO7介导肝癌中PRMT1表达和PHGDH甲基化抑制的临床相关性。通过分析临床人肝癌组织和癌旁组织样本，研究人员发现FBXO7在肝癌中低表达，且与PRMT1蛋白以及PHGDH精氨酸甲基化水平呈显著负相关。

FBXO7通过下调PRMT1抑制肝细胞癌生长

综上所述，研究人员发现FBXO7通过抑制肝癌中丝氨酸的合成而具有肿瘤抑制作用。FBXO7介导的PRMT1降解阻止PHGDH的甲基化和活化，从而抑制丝氨酸的合成，加重氧化应激，抑制HCC生长。因此，该研究揭示了FBXO7-PRMT1-PHGDH轴是调节HCC中丝氨酸代谢的关键机制。