EMBO Journal：魏民/冯云鹏/巴雪青团队联合揭示PKM2新功能调控肿瘤细胞代谢重编程

2024年5月，东北师范大学的相关研究人员在《EMBO Journal》（IF：11.4）上发表了题为“PKM2 functions as a histidine kinase to phosphorylate PGAM1 and increase glycolysis shunts in cancer”的研究论文，揭示了丙酮酸激酶M2（PKM2）作为组氨酸激酶的新功能，并促进PGAM1活性在癌细胞代谢重编程过程中促进糖酵解分流和大分子生物合成。

亮点概述：

丙酮酸激酶M2（PKM2）作为组氨酸激酶，通过转移磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团对磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1）的H11位点进行磷酸化。
去四聚体化有利于PKM2作为组氨酸激酶发挥功能，但不利于其糖酵解活性。
EGF-Src信号诱导的PGAM1 Y119磷酸化是PKM2识别和结合所必需的。
基于PGAM1 pY119开发的细胞渗透肽阻断PGAM1-PKM2的相互作用，从而减缓肿瘤生长。

研究背景：

代谢重编程是肿瘤发生的关键，也是肿瘤细胞的标志。迄今为止，与肿瘤细胞代谢重编程相关的最具特征的现象是Warburg效应，也被称为有氧糖酵解，即在正常氧浓度下，糖代谢类型从氧化磷酸化转向糖酵解。尽管越来越多的证据表明糖酵解及其分流途径在肿瘤细胞中发挥着重要的协调作用，但其潜在机制尚不清楚。

磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1）是一种糖酵解酶，催化3-磷酸甘油酸（3PG）转化为2-磷酸甘油酸（2PG）。目前已知PGAM1的酶活性是通过组氨酸11（H11）的磷酸化来启动的，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）衍生的磷酸盐似乎负责PGAM1 H11位点的磷酸化；然而，调控PEP依赖的PGAM1 H11位点磷酸化的分子机制尚不清楚。

研究人员首先研究了PGAM1与以PEP为底物的两种代谢酶丙酮酸激酶（PKs）和烯醇化酶（ENOs）的相互作用，发现只有PKM2 而不是ENO1直接与PGAM1相互作用。进一步研究了PKM2是否能够催化PGAM1磷酸化，数据表明PKM2对PGAM H11磷酸化的调节中起着重要作用。为了验证PKM2能够通过利用PEP作为磷酸基团供体来磷酸化PGAM1，研究人员建立了纯化的PGAM1和PKM2的体外激酶检测方法，发现PKM2确实能够磷酸化PGAM1。当PKM2被ENO1或PKM1取代，或PEP被ATP取代时，PGAM1 H11没有被磷酸化。此外，在PKM2的存在下，PGAM1活性升高，这与丙酮酸含量增加相一致，这可能是由于PEP的裂解和向PGAM1提供磷酸基团造成的。2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG）是PGAM1催化3PG 转化为 2PG 的中间体，通过将其位于C3位置的磷酸基团转移到H11使其发生磷酸化。研究人员进一步研究了2,3-BPG促进PGAM1 H11磷酸化的可能性，结果表明2,3-BPG不参与PKM2催化PGAM1 H11磷酸化，PKM2作为组氨酸激酶以PEP依赖性方式在H11 位点磷酸化 PGAM1。

PKM2是磷酸化PGAM1 H11位点的组氨酸激酶

PKM2要么形成活性四聚体，通常催化PEP和ADP转化为丙酮酸和ATP，要么形成活性较低的二聚体或无活性单体以调节其他细胞过程以满足肿瘤细胞的代谢变异。为了获得不同PKM2低聚物对PGAM H11磷酸化调节的功能见解，研究人员在细胞中添加TEPP46（PKM2激活剂）以稳定PKM2为四聚体，发现PKM2-PGAM1相互作用和PGAM1 H11磷酸化均被阻断。研究人员质谱分析比较了与四聚体 PKM2（含TEPP46）和去四聚体 PKM2（不含TEPP46）相关的蛋白质，结果表明去四聚体化有利于PKM2实现对PGAM1 H11的磷酸化。

由于PKM2是一种磷酸化酪氨酸结合蛋白，研究人员探究了PKM2-PGAM1相互作用是否依赖于PGAM1的酪氨酸磷酸化。使用重组蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）消除PGAM1的酪氨酸磷酸化后，发现PKM2与PGAM1的结合几乎完全消除，并且PGAM1在H11位点的磷酸化显著减少，表明PGAM1中的酪氨酸磷酸化可能对PKM2的结合很重要。进一步分析了PGAM1中的多个酪氨酸磷酸化位点，只有Y119对PGAM1-PKM2的相互作用具有功能影响。研究人员使用具有特异性识别PGAM1的pY119的定制抗体，发现PGAM1 Y119磷酸化在肿瘤细胞（A549、H1299、MCF-7 和 MDA-MB-231）中远高于未转化细胞（HBE-2和MCF-10A），这与肿瘤细胞中PGAM1-PKM2相互作用和PGAM1 H11磷酸化增强的观察结果相一致。这些结果表明PGAM1 Y119磷酸化是PKM2识别所必需的，并且对肿瘤细胞有益。

PGAM1 Y119 磷酸化是PKM2识别所必需的

PGAM1 Y119磷酸化构成了肿瘤细胞与正常增殖细胞之间的差异，并且EGF信号在许多肿瘤（如肺癌和乳腺癌）中被激活，并通过调节糖酵解酶的翻译后修饰在有氧糖酵解中发挥重要作用。因此研究人员进一步探讨了EGF信号转导在 PKM2调节PGAM1中的作用。结果表明酪氨酸蛋白激酶Src在生长因子信号诱导下对PGAM1 Y119位点产生磷酸化作用，而Y119磷酸化又增强了PKM2-PGAM1相互作用以及PGAM1 H11磷酸化。

为了证实PGAM1 Y119磷酸化在肿瘤细胞增殖中的作用，研究人员使用A549细胞耗尽内源性PGAM1后，PGAM1 WT细胞可显著恢复PGAM1的活性，而Y119F突变体细胞未恢复。PGAM1 Y119突变导致上游代谢中间体（如葡萄糖）的积累和下游中间体（如2PG）的减少。[¹³C₆]-葡萄糖示踪实验显示，糖酵解分流途径磷酸戊糖途径（PPP）和丝氨酸合成途径（SSP）中的代谢物（如5-磷酸核糖（R5P）和丝氨酸）在PGAM1 Y119F突变后合成受损。核苷酸合成的代谢中间体（如ATP和AMP）也显著降低。突变也导致了NADPH产生减少，NADPH不仅产生还原形式的抗氧化剂，还参与脂质合成。因此，PGAM1 Y119F突变也观察到活性氧（ROS）的增加和细胞脂质的减少。功能比较进一步揭示了Y119F突变导致的细胞增殖和细胞集落形成缺陷，在PGAM1 Y119磷酸化的破坏和PGAM1-PKM2相互作用的阻断下，糖酵解分流和肿瘤细胞增殖共同受到损害。研究人员在无胸腺裸鼠中进行了验证，这些结果表明PGAM1 Y119磷酸化对肿瘤生长至关重要。

PGAM1 Y119突变导致糖酵解分流和细胞增殖受损

为了验证 PGAM1-PKM2相互作用在肿瘤发展中的作用，研究人员检测了30名患者的肿瘤组织与邻近正常组织中PGAM1 pY119、PKM2和Src的水平。结果表明，由PKM2调节的PGAM1 pY119磷酸化可区分肿瘤组织与正常组织，可提示预后不良。基于肿瘤细胞中Y119磷酸化的特异性，研究人员设计了一种由PGAM1衍生的并含有磷酸化Y119的细胞渗透肽，并将其与HIV-TAT（pY119-TAT）融合。蛋白Co-IP检测显示，pY119-TAT肽干扰了A549细胞中PGAM1和PKM2之间的相互作用。进一步评估了pY119-TAT肽在无胸腺裸鼠体内的治疗潜力，结果表明含pY119的细胞渗透肽治疗会干扰 PGAM1-PKM2 的相互作用并限制了肿瘤生长。