Cell Death Differ：李纤/杨菲/王初课题组联合揭示衣康酸通过烷基化修饰GPx4抑制神经元铁死亡新机制

2024年5月，首都医科大学基础医学院李纤、杨菲教授课题组和北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心王初教授课题组联合在《Cell Death & Differentiation》（IF: 12.4）上发表了题为“Itaconate protects ferroptotic neurons by alkylating GPx4 post stroke”的研究论文，揭示了衣康酸对神经元铁死亡的潜在调控机制，Irg1/衣康酸/GPx4轴未来可能作为新的治疗策略，用于ICH后神经元保护，也为其他神经元铁死亡相关的中枢神经系统疾病（如缺血性中风和阿尔茨海默病）提供了新的治疗策略。

  研究背景：

脑出血（Intracerebral hemorrhagic stroke, ICH）是一种致残率和死亡率最高的卒中亚型，目前尚无有效的治疗方法。铁死亡是ICH后神经元死亡的重要方式，依赖于细胞内铁过载，由细胞膜富含多不饱和脂肪酸的脂质过氧化损伤触发。谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4, GPx4）可将毒性脂质过氧化物还原为醇，阻止脂质过氧化物积累，抑制铁死亡的发生。提高GPx4活性，对缓解ICH后神经元铁死亡，改善ICH预后具有重要的临床价值。

铁死亡细胞的代谢过程会被干扰。在线粒体中，三磷酸腺苷（ATP）的产生依赖于三羧酸（TCA）循环、电子传递链（ETC）和氧化磷酸化。TCA循环中的代谢物是否参与了神经元铁死亡尚不清楚。衣康酸为TCA循环的旁路代谢产物，在线粒体基质中由免疫应答基因1（immune-responsive gene 1, Irg1，Acod1编码）编码产物催化顺式乌头酸脱羧产生。然而，Irg1/衣康酸是否直接调节脑出血后的神经元铁死亡及其潜在机制目前尚不清楚。

研究人员首先分析了ICH后的超急性/急性期脑组织内TCA代谢物的变化，代谢组学分析结果显示ICH小鼠同侧脑组织中衣康酸（以及丙酮酸、乌头酸和富马酸）在第1天（神经元铁死亡的峰值时间）显著增加，只有衣康酸和乳酸在ICH后6小时也显著升高。小鼠同侧半球的冠状面质谱成像结果表明，在ICH后衣康酸显著增加，而琥珀酸和苹果酸水平不变。为明确衣康酸的增加是否由Irg1的表达上调引起，研究人员进一步观察了假手术和ICH小鼠脑组织中的Irg1表达情况。在ICH小鼠脑组织中，Irg1的mRNA和蛋白水平在第1天和第3天显著升高；而在构建Irg1^-/-小鼠中观察到Irg1和衣康酸水平降低。

为了研究Irg1/衣康酸对ICH是否存在有益或有害作用，研究人员使用Irg1^-/-小鼠和Irg1^+/+小鼠进行了ICH后的行为测试。结果表明，在ICH后，Irg1/衣康酸表现出内源性的有益作用。研究人员进一步在WT-ICH小鼠中腹腔注射4-辛基衣康酸（4-Octyl itaconate, 4-OI）以升高衣康酸水平，观察到Irg1/衣康酸可能通过挽救ICH急性期的纹状体神经元来改善ICH小鼠预后。

研究人员使用荧光原位杂交技术评估了Irg1的表达分布。Irg1主要在神经元和Iba-1⁺小胶质细胞/巨噬细胞（MMΦ）中表达，并且在ICH后第1天神经元中Irg1 mRNA水平显著升高。接下来研究人员探究了Irg1在MMΦ中的作用，结果表明，在ICH超急性期Irg1/衣康酸可以抑制神经元死亡和改善预后作用可能与MMΦ没有直接关系。随后研究人员进一步研究了神经元Irg1在体内的重要性，发现纹状体神经元Irg1/衣康酸可预防脑出血后的神经元死亡，缓解功能损伤。

为了探究Irg1/衣康酸在ICH中的神经元保护机制，研究人员培养了小鼠神经元细胞系N2A和原代皮层神经元并使用氯化血红素（Hemin，类似于典型的铁死亡诱导剂）构建了神经元铁死亡的体外模型。在原代神经元中，Irg1的表达水平随Hemin处理时间呈依赖性升高，使用siRNA敲低Irg1表达后加剧了Hemin诱导的原代神经元和N2A细胞的细胞死亡。外源性添加衣康酸和4-OI挽救了Hemin诱导的原代神经元及N2A细胞的铁死亡。同时，研究人员在人类多能干细胞（iPSCs）诱导分化的神经元中证实，衣康酸是抑制啮齿动物和人类神经元铁死亡的重要介质。

接下来，研究人员对衣康酸保护神经元免于铁死亡的潜在分子机制进行了研究。他们发现Irg1/衣康酸轴对神经元铁死亡的保护作用既不是通过Keap1/Nrf2途径介导的，也不是通过线粒体氧化呼吸介导的，表明衣康酸通过先前未知的机制来保护Hemin诱导的神经元铁死亡。

GPx4酶活性下降是神经元铁死亡的主要原因，可能是由谷胱甘肽减少引起的。在Hemin刺激的神经元中，GPx4的活性明显降低，而4-OI的加入显著增强了GPx4的活性。但是与Hemin处理或ICH小鼠相比，4-OI在体内和体外均未显著增加谷胱甘肽的含量。衣康酸具有亲电性，并在各种蛋白质上烷基化半胱氨酸残基。研究人员利用衣康酸特异性探针ITalk，结合化学蛋白质组学技术对GPx4上半胱氨酸修饰位点进行鉴定。质谱鉴定到三个修饰位点Cys28，Cys66和Cys107。研究人员接下来将三个位点分别进行突变、过表达后，利用ITalk探针进行位点结合实验验证。免疫印迹分析显示，GPx4 66位半胱氨酸突变和三个位点全突变后，ITalk对GPx4的修饰消失，这表明GPx4的66位半胱氨酸能够发生衣康酸修饰。研究人员又在GPx4-U46C纯蛋白中分别加入ITalk探针或者4-OI共同孵育后，通过质谱证明了ITalk探针和4-OI对GPx4的66位半胱氨酸的修饰。最后，为验证GPx4 Cys66位点修饰在衣康酸发挥神经保护作用中的重要性，研究人员在小鼠纹状体特异性敲除野生型GPx4或表达Cys66突变的GPx4，并给予4-OI治疗，结果显示，GPx4 Cys66位点的突变会阻断4-OI对ICH后铁死亡神经元的保护作用。

综上所述，研究人员利用体内、体外脑出血后神经元铁死亡模型，结合化学生物学、传统分子生物学和动物行为学等技术手段，首次发现Irg1/衣康酸轴通过烷基化修饰谷胱甘肽过氧化物酶GPx4保护神经元免于铁死亡，改善脑出血小鼠的不良预后。该研究阐明了神经元铁死亡调节的新分子机制，可能有助于改善ICH或其他与铁死亡相关的中枢神经系统疾病的患者恢复。