The Plant Cell：陈晓亚团队揭示拟南芥TETRASPANIN8介导外泌体分泌和糖基肌醇磷酸神经酰胺的分选和运输

 研究背景：

鞘脂是一类两亲性分子，具有由脂肪酸和鞘氨醇长链碱基(LCB)构成的神经酰胺骨架。在植物中，鞘脂可广泛分类为LCBs、神经酰胺（Cers）、羟基神经酰胺（hCers），葡糖基神经酰胺（GlcCers）和糖基肌醇磷酸神经酰胺（GIPCs）。GIPCs对植物的正常生长很重要，可以作为质膜（PM）中钠（Na⁺）或真菌毒素的信号受体。因此，研究GIPC分类和运输的机制可能有助于我们更好地了解植物对依赖于这类脂质的外部刺激的反应。TET8是四次跨膜蛋白家族的一员，由于其第四个跨膜结构域包含一个假定的鞘脂结合位点，因此被认为与GIPC相互作用。然而，TET8如何影响GIPC尚不清楚。

细胞外囊泡（EVs）是从细胞中释放出来的脂质结合囊泡，携带蛋白质、核酸、代谢产物和其他生物分子。目前对植物外泌体（30–100 nm的EVs）的生物发生和功能的理解仍然很有限，相关研究主要集中于高尔基体在多囊体（MVB）生物发生和调节外泌体成熟中的作用，这两者在外泌体的产生中都起着不可或缺的作用。

为了测试TET8和GIPC之间的相互作用，研究人员使用纯化的重组His-TF-TET8（TF，一种触发因子伴侣）和鞘脂进行了表面等离子体共振（SPR）测定。SPR分析表明，重组His-TF-TET8可以与植物鞘氨醇和神经酰胺强烈结合。脂质条带测试也检测到TET8和叶片GIPCs之间的直接相互作用。因此，TET8可能影响GIPC生物合成和/或参与GIPC转运。

位于高尔基体的肌醇磷酸神经酰胺葡萄糖醛酸转移酶1（IPUT1）参与GIPC的生物合成。脂质分析结果表明，TET8功能的丧失并不完全阻断GIPC合酶IPUT1的功能，然而，TET8功能的丧失降低了GIPC的最终浓度。此外，在tet8突变体中检测到高尔基体周围的囊泡较少，而过表达或敲低IPUT1都不会影响高尔基体囊泡的数量。IPUT1过表达没有使tet8突变体中高尔基体小泡的数量恢复到野生型（WT）水平。这些数据表明TET8可以与GIPCs结合，并通过高尔基体调节其含量，这可能与GIPC的生物合成平行。

TET8与鞘脂相互作用并作为GIPC载体

接着，为了研究TET8如何影响鞘脂，研究人员使用重组His-TF-TET8进行了亲和纯化-质谱联用（AP–MS），并通过免疫共沉淀（Co-IP）和Pull-down分析证实了外壳蛋白复合物I（COPI）亚基γ2-COPI和TET8的相互作用。根据TET8在膜中的拓扑结构，蛋白质可分为三个胞质结构域（N-末端部分、内环（IL）和C-末端尾部（C-尾部））、两个细胞外（EC）结构域（EC1和EC2）和四个跨膜结构域。通过对不同结构变体的分析，发现TET8的C-尾部对于蛋白质功能是必要的，包括提供γ2-COPI的识别信号和协助适当的亚细胞定位。

TET8的C-尾可以识别γ2-COPI并决定TET8的正确定位

鉴于TET8可以结合GIPCs并调节高尔基体功能，研究人员接着探究了其在鞘脂分选或运输中的作用。GIPCs是在高尔基体腔中合成的，而TET8功能的丧失导致高尔基体囊泡减少，研究人员分离出高尔基体并分析了它们的鞘脂含量，发现TET8的缺失会导致GIPCs在高尔基体中积累，而细胞中的GIPCs总量会受到影响。此外，COPI复合物对脂质稳态很重要，负责高尔基体内的运输和从高尔基体到内质网的逆向运输，还参与维持高尔基体形态和分选功能。研究人员进一步测量了过表达或敲低γ2-COPI的转基因系中的鞘脂水平以及高尔基体结构，发现GIPCs可能首先通过TET8在高尔基体膜上进行分选（可能在COPI的帮助下），然后与TET8一起被传送到PM的外叶或质外体空间，这个过程也伴随着EVs的释放。

TET8调节高尔基体囊泡出芽并调节GIPCs的输出