Nature Communications：定量脂质组学分析产品助力揭示由进食时间形成的节律性肝功能

研究背景：

肝脏时钟与饱食-空腹周期（或进食时间）密切相关。例如，日间/睡眠时间限制进食（DRF）可在7天内逆转肝脏时钟。DRF还通过昼夜节律时钟重置肝脏转录组的相位。最近，该研究团队证明，雌性小鼠的肝脏时钟和转录组，而不是代谢组，可被DRF授时。肝脏中转录组和代谢组反应之间的差异提出了一个问题，即蛋白质组水平上的日常节律变化是否对限时喂养期间肝脏（至少在雌性中）的昼夜生理学至关重要？

蛋白质磷酸化和泛素化是控制昼夜节律时钟的重要翻译后修饰（PTMs）。PTMs驱动着肝脏蛋白质组的日常节律。25%以上的位点和40%以上的蛋白质的磷酸化在肝脏中表现出昼夜节律振荡，其中包括雷帕霉素（mTOR）激酶机制靶标、胰岛素受体和表皮生长因子受体（EGFR）信号传导的底物。蛋白质泛素化在肝脏中是昼夜变化的，影响脂肪酸氧化、葡萄糖代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）通路信号传导。蛋白质乙酰化主要存在于线粒体蛋白质中，包括与柠檬酸循环、氨基酸代谢和脂肪酸代谢有关的蛋白质，这种类型的PTM受夜间/清醒时间限制性喂养（NRF）的调节。其他PTMs，如琥珀酰化和N-糖基化，分别调节肝脏的线粒体和分泌功能。然而，目前还缺乏关于限时喂养（TRF）期间蛋白质和PTM调节的系统观点。

昼夜节律稳定性方面的性别差异已经得到越来越多的认可。在哺乳动物中，雌性比雄性更能维持运动、内分泌系统、细胞代谢和基因表达的昼夜节律。然而， DRF对两性肝脏时钟和转录组变现出相当且完全的授时。因此，研究人员使用雌性小鼠的肝脏作为模型来揭示昼夜节律相对于相位调节的精细调节。

研究人员建立了一个数据库，描述了来自 TRF 雌性小鼠的肝脏中未修饰蛋白质和含有四种主要 PTM (磷酸化，泛素化，琥珀酰化和 N- 糖基化)的蛋白质组。取自同一群小鼠的样本，在两个完整的昼夜循环中每4小时采集一次。从每种TRF方案中获得节律蛋白或修饰蛋白的图谱，并比较 DRF 和 NRF 小鼠的相位调节模式。此外，研究人员还进行了跨组学综合分析，以揭示与进食时间相关的重要昼夜蛋白质特征。

时喂养小鼠肝脏的昼夜多组学分析

蛋白质组学分析表明，44.8% (2139/4778) 的磷酸化蛋白、37.8% (483/1277) 的泛素化蛋白、34.3% (1983/5773) 的蛋白质、15.7% (196/1252) N-糖基化蛋白和 1.9% (24/1286) 的琥珀酰化蛋白在 TRF 雌性小鼠的肝脏中呈现出节律性。几种PTMs中，磷酸化对营养的反应最灵敏，琥珀酰化最弱。基于相移的通路富集分析显示，大多数节律性途径的相移为4-5小时，而最富集的途径，如甘油三酯/胆固醇代谢过程、肽分泌调节和微体，其相移不超过8小时。综合模型表明，生物钟（特别是以p-PER2为代表）及其在脂肪酸代谢途径中的紧密相关蛋白质是小鼠肝脏响应TRF的关键昼夜节律特征。

脂肪酸代谢的生物钟调节是 DRF 下肝脏蛋白质组的一个关键特征

为了验证蛋白质组学的发现，研究人员分析了一组处于不同 TRF 条件下新的小鼠队列的脂质组。发现DRF授时肝脏中覆盖33个脂质类别的155种脂质，这大约是NRF小鼠肝脏中授时脂质数量的三倍。相位转化脂质主要由双（单酰基甘油）磷酸酯(BMP)和甘油磷脂组成。在 DRF 和 NRF 条件下，BMP 分别在睡眠和清醒时达到峰值，与进食时间同步。与NRF相比，DRF小鼠肝脏中的酰基肉碱类物质中度相移或锁相。值得注意的是，DRF在肝脏中诱导了80多种甘油三酯（TAGs）和8种甘油二酯（DAGs）的强烈昼夜节律.。相比之下，NRF只授时肝脏中一种TAG的昼夜节律，而它授时酰基肉碱（脂肪酸氧化所必需的）和甘油磷脂（主要是磷脂酰丝氨酸（PSs））的强烈昼夜节律。

研究人员通过靶向定量分析将 TAGs 和 DAGs 与单酰基甘油(MAGs)和生物物理相关脂质的分布进行了匹配。发现N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPEs)和 C20:1 MAG (MAG 20:1)的昼夜节律在DRF睡眠期达到高峰。豆蔻酰 MAG (MAG14:1)、油酰MAG (MAG 18:1)和N-酰乙醇胺(NEA，内源性大麻素，以油酰乙醇胺/18:1-EA和棕榈酰乙醇胺/16:0-EA为代表)在DRF小鼠中没有表现出节律性，而在NRF 小鼠的肝脏中表现出强烈的每日振荡。

脂质组学分析证实了 DRF 对脂肪酸代谢的授时作用

接下来，研究人员将这昼夜多级蛋白质组学数据集与最近发表的昼夜转录组学数据集（GSE150380）进行了比较。通路水平的连接图谱表明，在NRF和DRF下，蛋白质磷酸化和N-糖基化分别作为肝功能昼夜网络的枢纽。最后，通过诱变研究，研究人员发现昼夜节律抑制物PERIOD2在Ser971的磷酸化(PER2-pSer971)能够感知体内游离脂肪酸和葡萄糖的可用性。

昼夜转录组和多级蛋白质组的综合分析

总的来说，该研究生成了一个全面的基于蛋白质组学和脂质组学的数据库( http://www.circametdb.org.cn ) ，用于在限时喂养下的肝脏昼夜节律研究，这有助于阐明生理学和疾病中的时钟调节检查点。