Cell Metabolism：新型策略用于阐明磷脂酰胆碱代谢与整个基因组之间的不确定联系

2023年3月，东京大学等单位的相关研究人员在《Cell Metabolism》（IF: 31.4）上发表了题为“Organelle-selective click labeling coupled with flow cytometry allows pooled CRISPR screening of genes involved in phosphatidylcholine metabolism”的研究论文，开发了一种用于细胞器脂质全基因组筛选的策略，并成功应用于磷脂酰胆碱生物合成与转运相关的基因鉴定。

亮点概述：

细胞器选择性点击化学与流式细胞术（O-ClickFC）允许对活细胞中多个细胞器的磷脂酰胆碱（PC）进行基于荧光激活细胞分选（FACS）的分析。
O-ClickFC可区分PC合成和亚细胞移位缺陷的细胞。
O-ClickFC可进行针对细胞器PC表型的全基因组CRISPR筛选。
CHEK1、FLVCR1和CDC50A被鉴定为人类PC代谢的新关键基因。

研究背景：

细胞脂质代谢涉及复杂的蛋白质网络，其在时空上调节脂质合成和运输。因此，识别网络中的酶/蛋白质是解开脂质介导的生物过程（如细胞信号传导和细胞器内或细胞器间的膜运输）的分子机制的先决条件。磷脂酰胆碱（PC）是哺乳动物膜中最丰富的磷脂，其代谢异常与多种疾病有关，如癌症、脂肪营养不良等。然而，调控PC丰度和亚细胞分布的全蛋白网络仍然难以捉摸。

最近出现的全基因组CRISPR敲除（KO）筛选有可能为鉴定哺乳动物细胞中的关键遗传因子提供高通量平台。在典型的工作流程中，表现出感兴趣表型的细胞通过细胞活力或荧光激活细胞分选（FACS）进行物理分离，然后进行sgRNA丰度测序（NGS）以鉴定靶基因。当这项技术应用于识别PC调节网络时，需要将PC表型转换为简单的筛选读数。此外，还需要亚细胞水平的空间分辨率用以探索影响细胞器PC分布的关键基因。

研究人员开发了一种策略，将细胞器脂质表型转换成简单的荧光读数，用于全基因组筛选，命名为细胞器选择性点击化学与流式细胞术（O-ClickFC）。首先使用叠氮胆碱（N3-Cho）示踪剂通过内源性途径代谢掺入细胞内PC，再使用细胞器靶向可点击染料（OCD）对N3-PC进行内质网、高尔基体、线粒体和质膜外叶（OPM）的空间选择性标记。最后用流式细胞术测量靶细胞器中荧光标记的脂质，靶细胞器中N3-PC的丰度可以转换为相应OCD的荧光强度。该方法可以很容易地提供局部N3-PC丰度的信息快照，这允许解释表型是由于PC合成的全局异常还是亚细胞转运障碍而发生的。

流式细胞术分析亚细胞PC分布的工作流程

研究人员随后将O-ClickFC应用于全基因组CRISPR-KO筛选，首先关注的是与PC生物合成相关的基因。除了识别到PCYT1A, ACACA等先前报道的相关基因外，研究人员还试图通过关注未知或不清楚其参与PC合成的命中基因来获得新的见解。CTP：磷酸胆碱胞苷酰转移酶（CCT）是哺乳动物细胞中CDP胆碱途径（主要的PC生物合成途径）的限速酶，抑制CCTα（CCT的主要亚型）可以降低细胞内PC并抑制细胞生长。研究人员发现，检查点激酶1（CHK1）-细胞分裂周期因子25A（CDC25A）-细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）途径通过调节CCTα的C端丝氨酸残基的磷酸化状态来调节CCTα酶活性。此外，FLVCR1是主要促进因子超家族（MFS）的成员，以前被鉴定为质膜血红素输出者，但其与PC代谢相关的功能从未被报道。研究人员发现FLVCR1可促进胆碱的吸收，其缺失显著减少了细胞内内源性胆碱的数量。

CHEK1和FLVCR1在PC合成中的作用

随后，研究人员还应用O-ClickFC来鉴定与亚细胞PC运输相关的基因。除了鉴定到已报导的囊泡膜运输(SEC23B, RAB5C)和非囊泡转运(PITPNB, STARD7)相关的基因外，还发现CDC50A（编码磷脂翻转酶）功能的丧失既不影响PC生物合成以及质膜双层的总PC含量，但会下调细胞表面PC含量，影响了PC在质膜双层中的分布。