Nature Cell Biology: METALIC—追踪细胞器之间脂质转运通量的新策略

• 环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶（CFAse）在酵母中具有酶活性并可特异性且有效地标记细胞器中的磷脂。

• 使用针对“供体”和“受体”细胞器的两种酶为脂质添加两个不同的质量标签，通过质谱检测带有两个质量标签的脂质可量化两个细胞器之间的交换。

• 内质网-线粒体相遇结构（ERMES）和 Vps13-Mcp1 复合物在体内具有脂质转运活性，且前者贡献很大，后者贡献微小

细胞器的功能取决于构成细胞膜的脂质。膜脂不仅构成结构屏障，而且招募特定蛋白质并储存能量。真核细胞中的脂质生物合成主要发生在内质网（ER），脂质可通过囊泡转运运输到其它细胞器。过去十年表明，细胞已经进化出非囊泡机制来介导大部分脂质交换。非囊泡性脂质交换发生在细胞器之间紧密接触（10–30 nm）的部位，其中脂质转运蛋白（LTP）溶解膜上的脂质，保护它们远离疏水袋中的水环境，并催化它们在两个膜之间的交换。

在酵母中，ER-线粒体相遇结构（ERMES）是与ER-线粒体脂质交换有关的LTP的复合体。ERMES缺乏虽然导致生长缓慢和线粒体形态缺陷等表型，但并不能阻止ER-线粒体的脂质交换。另一个与线粒体脂质转运相关的LTP是Vps13，该蛋白通过单核细胞趋化蛋白-1(Mcp-1)与线粒体结合。当ERMES失活与Vps13或Mcp1缺失相结合时，会诱发致死性表型，这表明Vps13部分补偿了ERMES的缺失。然而，尽管ERMES和Vps13在体外表现出脂质转运活性，但它们在脂质交换中的冗余作用仍有待在体内证明。

虽然在膜接触部位发现了多个LTP，但我们对体内脂质转运和LTP功能的了解仍然很有限，这主要是由于现有工具的局限性。目前对磷脂转运的理解主要来自两种方法：使用放射性标记前体的体内测定和体外脂质交换测定。在典型的体内试验中，用3H-丝氨酸处理的细胞通过ER中的PS合成酶产生3H-磷脂酰丝氨酸 (PS)。由于PS脱羧酶Psd1从线粒体内膜(IMM)中的PS产生磷脂酰乙醇胺 (PE)，而甲基转移酶Cho2和Opi3仅在ER中从PE产生磷脂酰胆碱 (PC)，3H-PE和3H-PC的检测反映了ER-线粒体之间的脂质交换。然而这种测定有局限性。首先，它仅限于ER和线粒体。其次，磷脂酶可能会释放标记的脂质头基，这些头基可以通过肯尼迪途径重新结合到磷脂中，而与细胞器间脂质转运无关。最后，除了IMM，一小部分Psd1还定位于ER，这削弱了该测定的有效性。此外，尽管体外脂质交换测定可用于测试与脂质转运有关的LTP的活性，但缺乏脂质交换率、来源、目的地以及体内转运路线调节等信息。

为了解决这些局限性，研究人员开发了一种称为METALIC（细胞内脂质质量标记跟踪）的分析方法，在该方法中，脂质修饰酶针对感兴趣的“供体”区室，在那里它化学修饰脂质，引入诊断性的“质量标签”。在运输到“受体”区室后，质量标记的脂质遇到第二种引入不同质量标记的酶。因此，通过质谱（MS）检测双质量标记的脂质可以作为监测两个区室之间的脂质运输。重要的是，这种方法可以结合代谢标记来捕获脂质转运动力学。

环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶（CFAse）是一种可溶性细菌酶，在磷脂脂肪酰基链的双键处从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）引入亚甲基（-CH2-），形成环丙烷环。环丙烷类脂与不饱和类脂具有相似的生物物理性质，但带有可识别的+14 Da质量标签。研究人员在酵母中组成性表达CFAse，并通过MS测量最丰富的磷脂物种PC的环丙基化。质谱显示出现比前体PC物种+14 Da的峰值，证实了该酶在酵母中的活性。

此外。通过显微镜验证定位和Western验证表达，确认CFAse可以靶向特定的细胞器，且CFAse在细胞器中的表达不影响生长，表明细胞在受试细胞器中耐受环丙烷脂肪酸（CFA）。进一步使用 MS 对野生型细胞中的PS、PE、PC、磷脂酰肌醇 (PI) 和磷脂酰甘油 (PG) 进行定量后发现，细菌 CFAase可以特异性且有效地标记细胞器中的磷脂。

CFAse在酵母中具有活性和靶向性

为了监测 ER-线粒体脂质转运，研究人员利用PE甲基转移酶Cho2和Opi3的专属ER定位来引入一个质量标签，将CFAase 靶向线粒体基质以引入另一个质量标签。由于CFAase和甲基转移酶使用SAM分别作为亚甲基或甲基供体，研究人员用氘代蛋氨酸（d-蛋氨酸）脉冲标记细胞并监测单标记和双标记磷脂，后者指示ER和线粒体之间的脂质运输。

单独标记物种方面，研究人员监测了由ER头基的三重甲基化产生的 +9 Da PC 物种（三个氘化 -CH3 基团比三个非氘化基团重 9 Da）和 +16 Da PC 线粒体中PC环丙基化产生的物种。双重标记的物种具有 +25Da (9+16) 质量转移，这可能是由于头基标记的PC转运到线粒体或环丙烷标记的PE转运到ER。因此，该测量评估了两个传输方向。

为了验证该策略的特异性，研究人员测试了其对Sam5的依赖性，Sam5是SAM在IMM中的主要转运体。由于CFAse活性依赖于线粒体基质中的SAM，在sam5突变体中，质量标记受到严重损害。这显示出METALIC在体内监测ER-线粒体磷脂交换方面的稳健性和敏感性。

使用METALIC监测ER-线粒体脂质交换

为了评估ERMES和Vps13-Mcp1复合物在脂质交换中的冗余作用，研究人员试图在两种途径失活时测定脂质转运。为此，研究人员建立了一个生长素诱导型 degron (AID)系统来急性灭活ERMES，并能使用METALIC测定法测试其体内脂质转运活性。随后，研究人员用d-甲硫氨酸脉冲标记细胞，并在一种或两种途径失活时测定质量标签标记。结果发现，虽然这两种途径可能对转运的磷脂表现出一定的特异性，但ERMES和Vps13-Mcp1复合物在体内ER-线粒体间都有助于磷脂交换，这为它们的遗传冗余提供了生化基础。

最后，研究人员评估了METALIC是否可用于高等真核生物，发现在高等真核生物中，CFAase也可以通过细胞器特异性的方式修饰脂质。

内质网-线粒体磷脂交换动力学

综上所述，该研究展示了METALIC这一利用ER-线粒体作为模型细胞器对探测体内组织间脂质转运的多功能策略，加深了我们对ER-线粒体脂质交换的理解。它证明了两种候选途径的作用，Vps13–Mcp1通路对ER-线粒体脂质交换的贡献微小，而ERMES对脂质转运的贡献很大。此外，这两条途径以冗余的方式发挥作用，解释了两个细胞器之间的大部分脂质运输，潜在地解释了缺乏它们的突变体的杀伤力。METALIC的开发为阐明体内LTP功能和脂质转运过程铺平了道路。