税光厚/王院士/张福杰团队用多组学方法揭示新冠患者在不同感染阶段的血浆外囊泡的组成和功能

截至2021年6月上旬，根据世界卫生组织的数据，2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 在全球已感染超过16.9亿人，超过350万人死亡。COVID-19 主要是由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 引起的传染病，这种感染会引发无数代谢紊乱，可能会改变疾病进程的轨迹和最终结果。COVID-19发病的时间过程以病毒介导的对宿主代谢的直接影响以及宿主对病原体的反应引起的间接损害为标志。

外泌体最初被认为是细胞排泄不需要的物质的一种方式，后来的研究表明其参与细胞间的通讯，特别是在病毒传播和免疫反应方面。据报道，COVID-19 中富含外泌体的细胞外囊泡（EVs）的膜脂组成发生与疾病严重程度相关的改变。由于外泌体主要来源于多囊体（MVBs），而MVBs沿内吞途径集中了一半以上的膜胆固醇，因此胆固醇稳态对外泌体的生物学和功能产生了重要影响。

胆固醇稳态是介导SARS-CoV-2感染人体细胞的关键宿主途径。胆固醇和鞘磷脂（SM）也形成有序的筏膜微区，微调膜流动性和改变蛋白质定位。例如，γ分泌酶(GS)分别切割Notch-1形成Notch胞内结构域(NICD)和β -淀粉样前体蛋白(APP)形成β -淀粉样肽(Aβ)，在脂筏中表现出优先定位和增强活性。因此，EV膜脂组成可能会改变GS的定位和活性，从而调节与COVID-19病理相关的下游通路。

研究人员根据患者入院、出院的样本采集日期、SARS-CoV-2 RNA检测结果和相关实验室结果，将78例COVID-19患者的血浆样本分为4个时间阶段，包括症状前期（S1）、高炎症期（S2）、消退期（S3）和恢复期（S4）。研究人员利用差速离心和基于聚合物的沉淀从血浆样本中分离出富含外泌体的EVs。纳米级流式细胞术分析证实分离的EV的粒径分布与EV的理论粒径（<200 nm）一致，颗粒<180 nm的比例>85%，颗粒<300 nm的比例>98%。

沿着COVID-19的时间进程研究EV的组成

研究人员接着利用HPLC-MS/MS定量分析了富含外泌体的EVs的脂质组，重点研究了各种已知可引起免疫调节和抗病毒作用的胆固醇和各种固醇氧化衍生物。Z分数构建的全局聚类热图显示了COVID-19发病过程中EV脂质组变化的时间模式。观察发现，糖基化鞘脂，如具有很长链脂肪酰基（即C22-C24）的球三糖神经酰胺（Gb3s），在恢复期S4中相对于症状前期S1特异性降低。许多包含多不饱和脂肪酰（PUFA）的血浆磷脂酰乙醇胺（PEps）在症状前期S1中特异性升高。有症状的S2和S3的EVs中，髓鞘和胰腺β细胞的主要成分硫酸脑苷脂(Sulfatides, SLs)减少，但（部分）在恢复期S4中恢复。SLs调节自身免疫过程并调节胰岛的胰岛素释放以防止β细胞耗竭。此外，在消退期S3和高炎症期S2中分别观察到EV磷脂酰胆碱（PCs）和磷脂酰丝氨酸（PSs）的显著增加。

COVID-19中EV脂质组变化的不同时间模式

S2和S4 EV中的几种氧化固醇和固醇均升高，表明系统水平上胆固醇稳态失调。与S2相比，S1中的游离胆固醇、几种固醇以及氧化胆固醇衍生物明显减少。S1特异性氧化固醇被广泛认为是阻碍病毒复制的抗病毒化合物，其减少证实了正在进行的病毒复制和减弱的免疫反应的临床状态。值得注意的是，胆固醇衍生物6-酮-5α-羟基-胆固醇（6K-5α-OH-Cho）和3β-羟基-5-胆固醇酸（3β-hydoxy-5-cholestenoic acid）在S1中相对于S2显著增加。前者参与炎症和免疫反应的调节，抑制NK细胞介导的细胞毒性并阻碍CD8⁺ T淋巴细胞的细胞溶解活性，有助于S1的延迟免疫反应并阻碍病毒清除。后者是一种GS调节剂，除了抑制APP裂解外，还对 Notch 底物具有明显的抑制活性。此外，相对于S1，S2 EV中各种氧化固醇显着增加，包括5α,6α-环氧-胆固醇（5α,6α-epoxy-Cho），6α-羟基-5α-胆固醇（6α-hydroxy-5α-cholestanol）等，氧化固醇的普遍增加可能是由氧化应激和高炎症的整体状态引起的，这是 S2 的特征。7-烯胆固醇烷醇（Lathosterol）是循环中胆固醇生物合成的常规指标，在 S4 中显著增加，这表明胆固醇生物合成活跃。谷固醇是一种植物固醇，对病毒复制具有中等作用，是肠道胆固醇吸收的指标，其在S4中也升高。因此，恢复期S4表现出的EV固醇图谱表明胆固醇生物合成和摄取活跃。

除了固醇，研究人员还注意到恢复期S4中三酰甘油（TAGs）的显著增加。脂质相关性表明，EV TAGs与主要膜脂（包括PC、PE、PEp、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酰肌醇（PI））在S1中表现出强正相关。这种相关性在高炎症期S2中消失，在S3和S4中逐渐恢复。然而，与症状前期S1相比，恢复期S4中TAGs和膜磷脂之间的正协同调节仍然较弱。这些相关性表明储存TAGs的动员以驱动膜磷脂的生物合成，这在S1中很强烈，在S2中停止，然后在S3-S4中部分恢复。

沿着COVID-19的疾病轨迹被扰乱的脂质稳态

随后，研究人员对EVs进行了蛋白质组学研究，包含142个已鉴定蛋白质的主成分分析 (PCA) 显示S1和S2阶段分离良好。使用差异表达蛋白 (DEPs) 进行的KEGG通路富集分析表明，补体和凝血级联反应以及血小板激活是 COVID-19 过程中最主要的失调通路。研究人员观察到S1 EVs中补体C1r和C1s的显著增加。C1q、C1r和C1s是C1复合体的亚组分，构成补体激活的经典途径。相比之下，S2的EV蛋白质组则以抑制病毒传播的宿主驱动反应为特征。整合素β-3据报道可通过阻断病毒与ACE2受体的结合来抑制SARS-CoV-2进入细胞内，其在S2 EV中被观察到增加。此外，还观察到人类白细胞抗原I类组织相容性抗原Bα链（HLA-B）的S2特异性增加。HLA-B为溶解性CD8+T淋巴细胞提供病毒表位，并触发被感染细胞的清除。S2 EVs中，与高凝性疾病相关的蛋白质显著增加，包括纤维蛋白原γ链、纤维蛋白原α链和凝血因子V，它们参与先天免疫应答和干扰素γ介导的信号传导。

EV蛋白组在COVID-19四个阶段的时间变化

从高炎症到消退的转变表示疾病过程中的一个关键转折点。研究人员观察到，相对于S3，S2期筏脂质的比例（SM+Cho）/PC升高，EV膜各向异性增加。此外，GS的催化亚单位即早老蛋白1（PS-1）相对于血浆在EVs中富集，PS-1在高炎症期S2中特异性升高。为了确定来自肺上皮细胞的EVs对COVID-19的贡献，研究人员分析了分离的EVs中肺表面活性剂相关蛋白C（SP-C）的含量。SP-C仅在肺组织中表达，是一种与脂质相关的疏水性蛋白，主要在Ⅱ型肺泡上皮细胞中合成。结果发现，与S1相比，S2、S3和S4期的EV中成熟的SP-C增加。因此，症状出现后，肺内EV释放可能增加。S2 EVs也表现出白细胞介素-6（IL-6）和激活型Caspase-3水平的增强。IL-6在SARS-CoV-2感染引起的全身炎症中起关键作用。

最后，研究人员用从健康对照 (HCs) 和不同时间阶段的COVID-19分离的血浆EVs处理A549肺泡上皮细胞（作为代表原发感染部位的细胞类型）和 HepG2 细胞（肝细胞，代表次级、远端感染部位）。在37 ℃孵育后4小时，已经观察到被PKH67染料染色的EVs吸收到HepG2细胞中。在A549细胞中，真核翻译起始因子激酶4（EIF2AK4）通路被S2 EVs抑制，但被S3和S4 EVs 上调。控制真核翻译的途径，例如Reactome eukaryotic translation initiation和 KEGG ribosome，被S2 EVs抑制，但被S3和S4 EVs上调。不同阶段患者血浆EV处理的HepG2 细胞出现了不同的差异调节途径。Reactome pre-Notch expression and processing 通路在用S2 EVs处理的HepG2细胞中增加。Reactome hemostasis 通路被S2 EVs上调，被S3 EVs下调。

脂膜的各向异性改变了EVs的组成和功能

在这项研究中，研究人员发现，来自高炎症性S2的EVs的筏脂质和膜各向异性的增加与这些EVs中GS的定位和活性增强有关。GS介导的Notch-1裂解可能激活宿主炎症反应以对抗 SARS-CoV-2。S3 EVs中筏脂质和PS-1定位的减少可能有助于停止Notch信号传导并减轻全身炎症。S2期升高的Aβ肽含量表明GS 活性增强可能产生有害的代谢后果。Aβ肽在引发认知障碍方面的作用已被广泛报道，而认知障碍和脑雾等神经精神缺陷是急性后期COVID-19综合症公认的方面。

不同感染阶段的EVs具有不同的生物学特性

总而言之，该研究在COVD-19的时间轴上对富含外泌体的EVs的脂质组和蛋白质组的组成变化进行了探讨。与消退期S3期相比，在高炎症S2期富含外泌体的EVs中增强的PS-1定位有助于其对受体细胞的不同细胞反应。这些数据为将来的研究提供了有用的信息库，以阐明COVID-19发病机制中代谢失调和后果的机制线索。

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